在<巨噬细胞专题（上篇）>上篇中，给大家介绍了该篇文章的前期研究内容：1、外泌体提取方法及验证、从单核细胞诱导形成M0巨噬细胞的方法 2、验证胶质瘤细胞是如何促进巨噬细胞M2极化 3、通过体内外实验验证肿瘤源性外泌体miR-3591-3p促进巨噬细胞M2极化及促进肿瘤进展。那么，今天我们就接着上篇的内容，继续往下讲解：
第四步：miR-3591-3p靶向CBLB诱导巨噬细胞M2极化促进肿瘤细胞侵袭和迁移
四
问题9：miR-3591-3p进入巨噬细胞后，miR-3591-3p的作用靶基因是什么？
作者为了解决上述的问题，通过RNA测序技术，大量筛选miR-3591-3p的作用靶点：
分组如下：（1）对照组：miR-NC转染巨噬细胞 （2）实验组：miR-3591-3p模拟物巨噬细胞
经过对以上两组的RNA表达谱进行差异表达分析，并选取下调DEGs（差异表达基因）用于后续分析。注：选择下调DEGs作为对象，是因为miR-3591-3p为高表达，因此，根据ceRNA调控原理，则选下调基因。
其次通过在线数据库TargetScan 和 miRDB 预测miR-3591-3p 的潜在靶基因，并将预测到的靶基因与下调DEGs求取交集，结果共获得两个候选基因: DUT和CBLB。
接着，通过qRT-PCR验证DUT和CBLB在样本中的表达，结果发现：CBLB下调表达倍数更为明显，尤其选择CBLB作为miR-3591-3p潜在靶基因，继续后续研究。
最后，探讨CBLB与miR-3591-3p是否存在相互作用关系？作者通过荧光素酶报告基因验证两者间相互作用关系，结果显示：miR-3591-3p可以直接靶向CBLB。
问题10：既然研究的是肿瘤相关巨噬细胞，那么得看看CBLB与免疫反应、免疫微环境间是否存在相关性？
首先，作者以TCGA数据库的神经胶质瘤样本作为分析数据，通过ssGSEA方法对以上样本进行免疫打分并将其分为“高浸润组”和“低浸润组”，最后分析CBLB在高低免疫浸润样本中的表达差异，结果显示：高浸润组中CBLB显著低表达。
其次，通过TIMER数据库对多形性胶质母细胞瘤（GBM）和低级别胶质瘤（LGG）肿瘤微环境中的22种免疫细胞进行打分，并分析M2巨噬细胞与CBLB的表达相关性，结果显示：M2型巨噬细胞的浸润水平与GBM和低级别胶质瘤（LGG）的CBLB表达呈负相关。
结论：生信分析结果证明：CBLB与 TAM（肿瘤相关巨噬细胞） 的浸润密切相关。
问题11：CBLB与巨噬细胞表型转化是否存在直接的关系？
作者敲低CBLB表达，通过WB、qRT-PCR、ELISA及流式细胞检测M1和M2巨噬细胞特异性指标，结果显示：（1）WB和qRT–PCR结果表明，CBLB敲低显著提高了M2标记物的表达水平，但降低了M1标记物的表达水平。（2）ELISA显示IL10和TGFβ1的分泌增加，TNFα的分泌减少（3）流式细胞术分析显示，CBLB敲低显著增加了CD11bCD163细胞的比例。
结论：CBLB与巨噬细胞M2极化显著相关
问题12：巨噬细胞种的CBLB是否会影响胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力？？
作者通过共培养系统进行Transwell测定，结果表明，在敲低CBLB后，与巨噬细胞共培养的肿瘤细胞：侵袭、迁移能力明显增加。
综上所述，这些结果表明，miR-3591-3p可以直接靶向CBLB，诱导M2巨噬细胞极化，促进胶质瘤进展。
第五步：MiR-3591-3p 以依赖于 CBLB 和 JAK2/PI3K/Akt/mTOR和 JAK2/STAT3 通路激活的方式促进 M2 巨噬细胞极化
五
问题13：回复性实验反向验证CBLB在M2巨噬细胞极化种的重要性？
过表达CBLB，观察miR-3591-3p对巨噬细胞M2极化现象及肿瘤细胞侵袭和转移能力是否受到影响，结果显示：（1）在CBLB过表达后，miR-3591-3p对M2巨噬细胞极化的促进作用被逆转或部分逆转。（2）此外，CBLB的过表达逆转了miR-3591-3p过表达巨噬细胞对胶质瘤细胞侵袭和迁移的促进作用。
结论：这些结果表明，CBLB对于miR-3591-3p对巨噬细胞极化的促进作用不可或缺。
问题14：探讨miR-3591-3p通过靶向CBLB促进巨噬细胞极化的潜在机制？
（1）通过生信分析预测可能的机制：
首先，对差异基因进行功能富集分析，结果发现，差异表达基因显著富集在免疫、细胞代谢相关通路中；
其次，通过DisGeNET数据库分析基因与疾病之间关联性，结果显示：鉴定的差异表达基因与胶质瘤和肿瘤免疫相关；
最后，通过Ubi浏览器数据库预测CBLB（作为E3泛素连接酶，CBLB可以促进不同蛋白质底物的泛素化和降解）的底物，结果发现：JAK2是CBLB的直接底物。
（2）先前文献报道：1）JAK2以CBLB调节的方式泛素化和降解 2）JAK2/PI3K/AKT/mTOR和STAT3信号通路先前已被证明与巨噬细胞的表型转化有关，并且可能通过影响细胞的代谢模式而起作用。
结论：由此得出假设：miR-3591-3p可能通过JAK2 / PI3K / Akt / mTOR和STAT3信号通路促进巨噬细胞M2极化
问题15：实验验证假设是否成立？
作者进行了一系列蛋白质印迹分析，首先，发现GDE（胶质瘤来源外泌体）激活了JAK2 / PI3K / Akt / mTOR和STAT3途径。
其次，当miR-3591-3p在巨噬细胞中过表达时观察到相同的效果。
接着，当CBLB被敲低时，该途径中相关蛋白质的磷酸化增强。
最后，回复性实验表明，CBLB过表达部分减弱了miR-3591-3p过表达的影响。
结论：综上所述，我们的数据表明CBLB对于miR-3591-3p诱导的M2巨噬细胞极化至关重要，这是通过激活JAK2 / PI3K / AKT / mTOR和STAT3途径实现的。
第六步：体内外实验证明MiR-3591-3p促进细胞周期停滞和凋亡
六
细胞水平：
前期内容回顾：miR-3591-3p在外泌体中富集，并且神经胶质瘤细胞中miR-3591-3p表达水平显着低于正常神经胶质细胞。
问题16：进一步探索miR-3591-3p在胶质瘤细胞中的作用？
（1）我们将miR-3591-3p模拟物或miR-NC转染到胶质瘤细胞中并进行转录组测序。GO对下调基因的分析表明，这些基因中的大多数在有丝分裂和细胞周期生物过程中显着富集。
（2）接下来，我们在神经胶质瘤细胞中过表达miR-3591-3p，流式细胞术分析显示这些细胞中的G2 / M停滞。
（3）其次，我们分析了G2 / M相关蛋白的表达，发现CyclinB1表达减少，但p-CDK1表达显着增加。
（4）最后，我们观察到，当miR-3591-3p过度表达时，细胞凋亡率明显增加，同样，细胞凋亡相关蛋白的表达也表现出与上述趋势一致的趋势。
结论：miR-3591-3p过表达促进细胞凋亡，该基因为抑癌基因。
动物水平：
荧光素标记的U118MG细胞（产生LV-miR-3591-3p细胞）中稳定地过表达miR-3591-3p，并将其注射到裸鼠的大脑中以建立颅内原位异种移植模型。
（1）生物发光成像显示，植入LV-miR-3591-3p细胞的小鼠的荧光素酶信号远低于携带LV载体细胞的小鼠，并且存活时间更长。
（2）此外，HE染色显示miR-3591-3p过表达后肿瘤体积显着减小。
（3）IHC结果证实，LV-miR-3591-3p组中Ki67阳性细胞的数量显着减少，但Bax阳性细胞的数量增加。
第七步：miR-3591-3p 靶向 MAPK1 并通过 MAPK 信号通路抑制神经胶质瘤生长
七
问题17：第四步讲的是miR-3591-3p在巨噬细胞中促进肿瘤进展的作用。那么作为一个抑制基因，在肿瘤细胞中的作用机制是怎样的？
（1）作者通过mRNA测序（mRNA-seq）以确定用miR-3591-3p模拟物和miR-NC转染的神经胶质瘤细胞中差异表达的mRNA及预测其靶基因后求交集。
结果筛选到了75个差异靶基因。接着对这75个靶基因进行功能富集分析，其中发现7个显著富集在MAPK通路中。
（2）表达水平验证及相互作用位点验证：在7个候选靶基因中，只有MAPK1在U118MG和U251细胞系中被miR-3591-3p显着下调。
（3）为了进一步确定miR-3591-3p是否直接与MAPK1的3′-UTR结合，作者在HEK-293-T细胞中进行了双荧光素酶并确定两者间存在相互结合关系。
问题18：为了探索MAPK1在神经胶质瘤细胞中的作用？
我们使用siRNA敲低了MAPK1。并通过一系列手段验证细胞周期和凋亡指标，结果显示：（1）流式细胞术结果显示MAPK1敲低时G2 / M期停滞
（2）采用WB检测G2/M相关蛋白，发现CyclinB1表达显著下降，而p-CDK1表达呈相反趋势。
（3）细胞凋亡分析显示，MAPK1敲低组凋亡细胞数量显著高于对照组。
（4）接下来，检查细胞凋亡相关蛋白的活性，包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax和裂解半胱天冬酶-3。
结论：WB分析表明，siRNA转染增强了促凋亡蛋白的表达，但抑制了抗凋亡蛋白的表达。
问题19：为了进一步阐明胶质瘤进展的抑制是否通过miR-3591-3p-MAPK1轴介导？
作者在胶质瘤细胞中过表达MAPK1并进行功能回复性实验，以验证MAPK1是否能够挽救miR-3591-3p的表型效应。
结果显示：（1）G2/M因MAPK1的过度表达而被废除。
（2）当MAPK1过度表达时，凋亡细胞的百分比显着恢复
（3）然后分析表达水平G2 / M相关和细胞凋亡相关蛋白质，结果与上述流式细胞数据分析结果一致。
（4）我们之前的生物信息学分析结果表明，miR-3591-3p可能通过MAPK途径起作用。因此，我们进一步研究了miR-3591-3p和MAPK1对MAPK途径的影响。事实上，在用miR-3591-3p模拟物转染的神经胶质瘤细胞中，p-ERK，p-c-Fos和p-ELK1水平降低，而miR-3591-3p抑制剂的转染则导致相反的趋势。此外，MAPK1敲低显著降低了 p-ERK、p-c-Fos 和 p-ELK1 的水平。
结论：综上所述，上述研究结果表明，miR-3591-3p对神经胶质瘤细胞的抑制作用是通过直接靶向MAPK1和抑制MAPK途径介导的。
文献讲解完啦，文中给我印象最深的是：作为抑癌基因miR-3591-3p为什么能够促进肿瘤进展？这应该也是本文的亮点之处！
转自：“中北科研”微信公众号
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