▲第一作者：张红榴
通讯作者：朱敦明，吴洽庆，陈曦
通讯单位：中国科学院天津工业生物技术研究所
论文DOI：
https://doi.org/10.1021/acscatal.3c01569
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通过改造羰基还原酶同时提高对大位阻酮底物和异丙醇的催化活性极具挑战性。本文通过底物通道及活性口袋重塑的方法，同时提高了来自Sporobolomyces salmonicolor 的羰基还原酶SSCR对大位阻酮底物及异丙醇的催化活力，该突变酶催化异丙醇的氢转移反应实现了2-甲（邻苯二甲酰亚）胺-3-氧丁酸甲酯（1a）的动态动力学不对称还原，生成单一构型（2S,3R）产物，光学纯度>99%。该研究揭示了羰基还原酶的设计改造可以同时提高其对体积和性质差别很大的底物的催化活性，也为此类底物的动态动力学拆分提供了一种高效的生物催化方法。
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背景介绍
羰基还原酶是一类烟酰胺辅酶依赖的氧化还原酶，可催化醇与酮或醛之间的相互转化。其辅因子可通过酶偶联体系或底物偶联体系进行再生，异丙醇作为底物的底物偶联策略，反应体系简单，副产物丙酮易于从反应混合物中去除，且异丙醇可以作为助溶剂，促进溶解度差的羰基底物在水溶液中的扩散。这种策略要求酶同时具有还原目标酮底物和氧化共底物异丙醇的活性，然而，由于大位阻酮底物与异丙醇结构大小和性质相差很大，缺乏此类生物催化剂，改造过程中，在提高大位阻酮底物活力的同时，对异丙醇的活力会降低，所以通过改造同时提高两者的活力极具挑战性。
本文所研究的（2S,3R）-2-甲胺基-3-羟基丁酸酯化合物是β-内酰胺类药物的关键中间体，可通过对2-甲胺基-3-氧羧酸酯（1a,1b）动态动力学还原拆分合成，化学催化转化的反应条件苛刻，缺少合适的高效生物催化剂。
03
研究出发点
通过改造同时提高羰基还原酶对2-甲胺基-3-氧羧酸酯类底物及异丙醇的催化活力，不仅能够解决此类底物高效动态动力学拆分难的问题，建立相应的绿色合成工艺，而且通过底物通道及活性口袋的重塑可同时提高两个结构及性质相差较大底物的催化活力，也为其它类似的改造提供重要的指导意义。
04
图文解析
（2S,3R）-2-甲胺基-3-羟基丁酸酯化合物是β-内酰胺类药物的关键中间体，可通过对2-甲胺基-3-氧羧酸酯（1a,1b）的动态动力学拆分获得，化学催化转化可以达到较好的立体选择性，但是反应条件苛刻，缺少合适的高效生物催化剂（图1）。
▲图1 消旋体1的动态动力学拆分
首先以1a为模式底物对实验室的数百种羰基还原酶进行筛选，通过筛选发现，来自Sporobolomyces salmonicolor AKU4429的羰基还原酶SSCR可催化1a生成（2S,3R）构型产物(ee>99%, dr 70/30)，其突变体M1（M242F/Q245T）展现出更好的转化率和立体选择性（ee>99%, dr 95/5）（表1）。
▲表1 羰基还原酶库筛选结果
为了进一步提高突变体的活力，作者在M1的基础上继续改造，通过同源建模，底物酶分子对接，分析相互作用关系，选取V95/F97, T134/V135, N207/Y208，P243/P244，W226, Q171构建饱和或半饱和库进行筛选，获得突变体M1/Q171N,和M1/Q71K活力及选择性进一步提高（表2）。转化结果表明，M1/Q171K可利用异丙醇进行辅酶再生动态动力学拆分还原1a生成（2S,3R）构型产物，20 h可转化110 g/L底物，ee值和de值均大于99%。
▲表2 SSCR及突变体对1a和异丙醇的活力及选择性
为了分析各突变位点的作用，构建单突变体同时测定酶比活及动力学参数（表3），结果显示M242F对异丙醇的活力提高9倍，但对1a的活力降低至1/10，Q245T对1a的活力提高近8倍，但两者组合起到协同促进的作用，相对于野生型，对1a和异丙醇的活力分别提高12和6倍。
▲表3 SSCR及突变体的酶活及动力学参数
为了进一步解释突变体对1a和异丙醇催化活力提高的分子机制，在晶体解析的基础上，与底物分子进行对接，通过M1底物通道分析（图2）和分子动力学计算（图3），表明M242F对异丙醇活力提高的原因是由于底物入口通道变窄，减少了异丙醇从底物结合位点的逃逸，从而增强了活性。相比之下，突变体Q245T对1a的酶活性是野生型酶的近8倍，这可能是由于底物结合腔的扩大。这两个突变在M1中的协同作用导致了1a和异丙醇的活性都增强。
▲图2 M242F和SSCR底物通道分析
▲图3 1a与SSCR及突变体的对接结果及分子动力学模拟结果
05
总结与展望
通过改造同时提高羰基还原酶对大位阻酮底物和异丙醇的活性，利用底物偶联的辅酶循环系统实现酮底物的还原极具挑战性。在本研究中，考虑到（2S,3R）-2-甲胺基-3-羟基丁酸酯化合物在β-内酰胺类药物合成中的重要性，以2-甲（邻苯二甲酰亚）胺-3-氧丁酸甲酯（1a）为底物筛选一系列羰基还原酶，发现SSCR突变体M242F/Q245T同时提高了对1a和异丙醇的活性，通过进一步改造，获得突变体M1/Q171K可利用异丙醇做为共底物进行辅酶循环，实现了1a的动态动力学不对称还原，20 h可转化110 g/L底物，ee值和de值均>99%。通过对接模拟及分子动力学分析，发现这可能是由于底物通道变窄及活性口袋重塑的协同作用。因此本研究不仅提供了高效的生物催化剂，可实现1a的动态动力学拆分生成单一构型目标产物，解决此类底物动态动力学拆分难的问题，而且首次展示了可以通过蛋白质工程改造同时提高羰基还原酶对大位阻酮底物和小分子异丙醇的活性，从而通过底物偶联实现辅因子的再生。
本研究获得国家重点研发项目国家重点研发计划（2018YFA0901600）、国家自然科学基金（92056101）、天津市合成生物技术创新能力提升项目（TSBICIP-KJGG-009）的支持。中国科学院天津工业生物技术研究所助理研究员张红榴为本论文的第一作者，朱敦明研究员、吴洽庆研究员和陈曦副研究员为该论文的共同通讯作者。
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通讯作者介绍
朱敦明研究员简介：
朱敦明，博士生导师，中国科学院天津工业生物技术研究所研究员、天津市生物催化技术工程中心主任。1993年毕业于中国科学院上海有机化学研究所，获有机化学专业博士学位。研究方向为合成化学与合成生物学的交叉领域，开展系统生物催化理论和技术方法的研究,开发绿色生物合成技术及其在化学工业中的应用,探索生物催化二氧化碳固定化的反应机理及其高值化利用。在Nat. Catal.、Nat Chem.、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、ACS Catal.、Green Chem.、Chem. Sci.、Org. Lett.及Adv. Synth. Catal.等刊物发表论文150多篇，出版英文专著( Chemo-enzymatic Cascade Reactions, Wiley)，获得授权发明专利20余项，应用研究方面实现了6项成果的技术转让，生产规模达到每年100-10000吨的规模，担任多种学术期刊的编委。
吴洽庆研究员简介：
吴洽庆，博士生导师，中国科学院天津工业生物技术研究所研究员。2004年毕业于四川大学华西医院，获遗传学专业博士学位。主要从事生物催化剂的发现、改造及在手性化合物生物催化合成中应用工作。近5年来在Nat. Catal.、Angew. Chem. Int. Ed.、ACS Catal.、Green Chem.、Org. Lett.及Adv. Synth. Catal.等刊物发表论文40多篇, 在应用研究方面，实现了6项成果的技术转让，获得授权发明专利20余项。
陈曦副研究员简介：
陈曦，硕士生导师，中国科学院天津工业生物技术研究所副研究员。2010年毕业于四川大学化学学院，获得化学生物学专业博士学位。主要研究领域是生物制造手性化学品，利用生物催化转化的特点，以羰基还原酶和l-苏氨酸醛缩酶为主要研究对象，针对性开发医药中间体、原料药的绿色生物制造新工艺，实现了一系列多官能团化合物手性中心的精准构建。在Nat. Catal.、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、ACS Catal.、Org. Lett. J. Org. Chem.及Adv. Synth. Catal.等刊物发表论文50多篇，获得授权发明专利10余项。
原文链接:
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.3c01569
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