▲第一作者：Chu Zheng、Zhe Ji
通讯作者：Steven G. Boxer
通讯单位：美国斯坦福大学
论文doi：
https://doi.org/10.1038/s41557-023-01287-x
01
背景介绍
酶是经过数十亿年进化而来的具有选择性的催化剂。由于其惊人的催化能力，合理设计优于酶的蛋白质，特别是在其天然功能方面，仍然是一个巨大的挑战。目前设计的酶通常表现出相对较差的活性。越来越多的证据表明，带电和极性酶活性位点产生的电场对酶催化有重要贡献。然而，这种静电催化原理在很大程度上已经被证明是通过使电场和催化速率更小。是否可以通过更强的静电制造更快的酶和催化剂仍然是一个开放性问题。基于物理原理的酶的设计和改进仍然具有挑战性。
02
本文亮点
1.本工作证明了静电催化的原理可以用来大幅度提高天然酶的活性。通过用苏氨酸取代丝氨酸氢键供体，用Co2+取代具有催化作用的Zn2+来增强马肝醇脱氢酶的活性位点电场。
2.基于电场增强，本工作对反应速率的增加进行了定量预测。电场增强的酶催化作用比天然酶快50倍，这与实验测量结果非常吻合。氢键和金属配位这两种截然不同的化学作用力的影响由一个统一的物理量-电场来描述。电场是可定量的，在这里表现为可加性和可预测性。
3.这些结果为生物和非生物催化剂提供了一种新的设计范式。
03
图文解析
▲图1. LADH的静电催化作用
要点：
1、LADH催化一个可逆反应，即NAD+将醇氧化成醛、酮或NADH将醛、酮还原为醇。在还原途径中(图1a)，LADH、辅因子NADH和醛酮类物质底物形成三元复合物，其中底物中的羰基(C=O)与具有催化作用的Zn2+和氢键供体发生强相互作用。
2、C=O受到来自NADH的氢化物的亲核进攻，随着C=O键的伸长和沿键轴的更多电荷分离而进入过渡态。因此，过渡态的C=O比反应物态的C=O具有更大的偶极矩(μTS) (图1b)。
3、这里电场是否可以变大，ΔGć是否相应减小(图1c)。这是对静电催化原理及其在一般功能性酶和催化剂设计中的应用的终极实验检验。
▲图2. LADH活性位点的金属交换
要点：
1、如图2a所示，LADH活性中心的催化Zn2+采用由H67、C46和C174残基组成的四面体配位几何构型，第四个配体为底物的C=O或本工作中的抑制剂N -环己基甲酰胺(CXF)。
2、通过系统改变金属离子浓度和测定醇脱氢活性对金属插入进行了优化(图2b)。本工作获得了天然LADH、LADHCo和LADHCd的晶体结构。
3、利用同位素标记的红外光谱，本工作确定了CXF与LADH天然型和突变体结合的C=O振动峰。与LADHZn相比，LADHCo催化丙酮加氢的kcat提高了14倍。与LADHZn相比，LADHCd表现出略小的kcat。
▲图3. LADH活性位点的氢键扰动
要点：
1、接下来，通过构建S48A和S48T突变体，对活性位点的另一个关键贡献者S48的氢键进行了扰动，发现S48A和S48T仍然可以结合CXF (图3a)。S48A突变消除了氢键相互作用，使C=O带明显蓝移，投影在C=O上的活性位点电场降低至-139 MV cm-1。
2、与天然酶相比，S48A突变使丙酮加氢的kcat降低了80倍，而LADHS48T突变使丙酮加氢的kcat增加了6.3倍(图3c)。尽管S48A突变直接移除了氢键，但是金属交换和S48T突变并没有对结合的C=O产生显著的结构变化，从晶体学(图2c和3a)可以观察到。它们的静电效应可以通过振动光谱的直接读数来进行量化。
▲图4. 酶催化与设计的统一静电学基础
要点：
1、如图4a、b所示，反应的自由能垒(∆Gć)与活性位点电场在两个参数的宽范围内均呈线性相关，这表明氢键和金属离子的催化作用尽管具有不同的化学性质，但都具有共同的静电性质，可以用电场来定量描述。
2、为了测试作为物理量的电场是否具有可加性，本工作设计了双突变体，利用单突变体的效应之和。具体来说，即设计了LADHCo,S48T和LADHCo,S48A，并对它们的电场和活性(图4c、d)进行了定量预测。
3、这些阴性和阳性对照实验清楚地证明了电场的可加性和对酶活性的精确静电控制，它既能优于天然酶，又能填补连续的活性谱(图4e,f)。
4、图4f中总结的结果有些出人意料，因为线性相关性不仅扩展到比天然酶更慢的速率和更小的场，而且扩展到更大的速率和场。这提示了一种在酶设计界基本没有的通用策略：专注于由活性位点的元素所创造的电场。这些概念普适于化学反应性，不管是有组织环境中的生物反应还是非生物反应。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41557-023-01287-x
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