联合孟德尔随机化分析，揭示骨质疏松一种全新机制

2023年2月27日，浙江大学附属医院骨科研究中心严世贵课题组在氧化还原领域权威期刊，中科院一区TOP杂志《REDOX BIOLOGY》上在线发表了题为“GSTP1-mediated S-glutathionylation of Pik3r1 is a redox hub that inhibits osteoclastogenesis through regulating autophagic flux”（IF：10.787）。发现GSTP1可以通过Pik3r1的Cys498和Cys670上调S-谷胱甘肽化水平，从而抑制其磷酸化，进而通过Pik3r1-AKT-mTOR轴调控自噬通量的变化，影响体外破骨细胞的分化，最后在体外调控破骨细胞的形成。

研究背景

骨质疏松症是一种以骨量减少、骨折风险增加为特征的代谢性骨病，主要表现在骨密度方面。由于世界人口老龄化，骨质疏松症往往会导致骨折等严重后果，并导致更昂贵的医疗费用，这是一个不可低估的挑战。因此，重视预防和治疗骨密度下降和骨质疏松症具有深远的临床意义。由其他疾病或药物暴露而加重的骨质疏松症会导致继发性骨质疏松症。30%的女性、>50%的绝经前女性和50%-80%的男性可患此病。此外，血液病和骨骼健康之间的关系在许多临床观察性研究中是发人深省的

主要方法

（1）孟德尔随机化

（2）单细胞测序

（3）氧化还原质谱

（4）免疫共沉淀

（5）非变性非还原免疫印迹

（6）流式细胞术

（7）质谱分析

（8）CRISPR-CAS9基因编辑

研究结果

（1）本研究采用孟德尔随机化分析来证明骨髓增生异常综合征（MDS）和骨矿物质密度之间的潜在关联。通过骨矿物质密度相关GWAS数据库发现GSTP1可能影响BMD。为了进一步探索GSTP1在骨髓细胞结构中的表达，利用骨髓单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集进行生物学分析。结果表明，GSTP1在骨髓单核细胞中高表达，而GSTP1在老年女性（骨密度相对较低）中的表达低于年轻女性。WB显示，GSTP1的表达随着分化时间的增加而降低。此外，WB和免疫组化结果显示，卵巢切除（OVX）组GSTP1明显低于SHAM组。由于破骨细胞主要来源于骨髓单核细胞，所以说，GSTP1对骨矿物质密度的潜在影响更有可能通过破骨细胞而不是成骨细胞的作用发生。

（2）GSTP1药理学抑制剂TLK199促进破骨细胞形成呈剂量依赖性。同时，当M-CSF和RANKL刺激小鼠骨髓单核细胞（BMMs）3天后，TLK199对NFATc1、Acp5、c-Fos、CTSK等破骨细胞相关基因的表达也有剂量依赖性上调作用。为了明确GSTP1对破骨细胞的影响，用NC-siRNA、GSTP1-siRNA转染BMMs，并通过转染GSTP1-shRNA在Raw264.7细胞中下调GSTP1水平。TRAP染色显示，GSTP1-siRNA组形成的破骨细胞和细胞核数量多于NC-siRNA组，GSTP1-siRNA组中NFATc1、Acp5、c-Fos等破骨细胞特异性蛋白的表达水平也较高。在Raw264.7细胞中，GSTP1-shRNA组也验证了相同的WB结果。TRAP染色结果显示，rGSTP1能够抑制BMMs的破骨细胞分化，下调NFATc1和Acp5等破骨细胞特异性蛋白的表达。Flag-GSTP1组在Raw264.7细胞中的WB结果也相同。这些发现共同表明GSTP1可能在破骨细胞发生中起抑制作用。

（3）为了研究GSTP1如何影响破骨细胞，在M-CSF和RANKL刺激条件下，透射电镜（TEM）图像显示rGSTP1组出现更多的自噬囊泡和吞噬囊泡。在BMMs分化第3天，外源性升高rGSTP1显著提高LC3-II/I比值，降低SQSTM1/p62蛋白水平。此外，当使用GSTP1-siRNA在BMMs中敲除GSTP1时，GSTP1水平的降低在前3天下调了破骨细胞形成的自噬通量。WB结果显示转染Flag-GSTP1的细胞在破骨细胞分化过程中LC3-II/I比值升高，SQSTM1/p62蛋白水平降低。相反，在稳定转染GSTP1-shRNA质粒的细胞中，低水平GSTP1组的LC3-II/I比值较低，SQSTM1/p62蛋白水平较高。rGSTP1刺激的细胞显示出更高的mCherry：GFP比例。相比之下，转染GSTP1-siRNA的Raw264.7细胞中，黄色和红色斑点比NC-siRNA组少。同时，当GSTP1被敲除时，细胞中mCherry：GFP的比例降低。低水平GSTP1促进的破骨细胞生成也被逆转。因此，上述结果提示GSTP1通过调节分化过程中的自噬通量来调节破骨细胞的发生。

（4）rGSTP1在BMMs分化过程中没有改变p110的磷酸化水平，但确实下调了磷酸化的Pik3r1水平。GSTP1的过表达抑制了磷酸化的Pik3r1-AKT-mTOR信号级联。在M-CSF和RANKL刺激5天后，GSTP1水平的降低增加了Pik3r1-AKT-mTOR信号通路。LY3023414可以抑制Pik3r1磷酸化和AKT磷酸化水平，Acp5表达水平被逆转。TRAP染色结果也显示LY3023414逆转GSTP1敲低促进的破骨细胞分化。上述结果表明，GSTP1在破骨细胞发生过程中通过Pik3r1-AKT-mTOR信号级联介导自噬通量。

（5）GSTP1可能上调Pik3r1的s-谷胱甘肽化水平，但不上调p110、AKT或mTOR的s-谷胱甘肽化水平。此外，共免疫沉淀结果显示，外源性rGSTP1在分化第3天的破骨细胞形成过程中增强了Pik3r1的s-谷胱甘肽化水平，下调了Pik3r1的磷酸化水平。相比之下，当使用GSTP1-siRNA下调GSTP1水平时，共免疫沉淀结果显示，Pik3r1的s-谷胱甘肽化进一步下调。相应的，激酶的磷酸化得到改善。综上所述，GSTP1可以在破骨细胞形成过程中上调Pik3r1的s-谷胱甘肽化，并进一步抑制激酶活性。

（6）利用不同物种的初步序列比对和Consurf软件，发现Pik3r1中的4个半胱氨酸（Cys498、Cys656、Cys659、Cys670）具有进化保守性。在Cys498和Cys670发生了s-谷胱甘肽化。此外，分子蛋白对接结果也显示，Cys498和Cys670更可能与GSH发生相互作用。谷胱甘肽与蛋白Pik3r1-CYS498共价对接后，谷胱甘肽与GLN499和GLU502形成氢键，并与LYS532和GLU502发生静电相互作用。同样，GSH与HIS669、HIS668、ARG649和VAL671形成氢键，并与ARG649存在静电相互作用。综上所述，Cys498和Cys670是Pik3r1的s-谷胱甘肽化位点。

（7）WB结果进一步证实敲除Pik3r1不影响GSTP1水平，转染等量pcDNA3.1-Myc-Pik3r1（WT）和pcDNA3.1-Myc-Pik3r1（C498A，C670A）均未影响GSTP1水平。通过体外实验证明，Cys498和Cys670是GSTP1介导Pik3r1的s-谷胱甘肽化的两个位点，这种氧化还原相关的修饰可通过Pik3r1-Akt-mTOR级联调节自噬通量，最终抑制破骨细胞的发生。

（8）以TLK199（50mg/kg）和生理盐水分别治疗OVX小鼠1个月，设假手术组（sham）、OVX组和OVX+TLK199组。Micro-CT结果显示，TLK199处理的OVX小鼠骨量减少。GSTP1的特异性药理学抑制剂TLK199加剧了OVX小鼠的骨质流失，而外源性GSTP1重组蛋白逆转了OVX小鼠的骨质疏松症。

总结

上述数据表明GSTP1调节破骨细胞发生的新机制。GSTP1首先上调Pik3r1的s-谷胱甘肽化，这种修饰可以抑制激酶磷酸化活性，并通过Pik3r1-Akt-mTOR信号级联调节自噬通量，从而抑制破骨细胞的发生并改变其形成命运。以GSTP1为靶点进行破骨细胞生成可能为骨质疏松症的治疗提供了一个潜在的方向。鉴于TLK199在临床试验中对MDS患者的积极治疗效果，以及对肺部相关疾病的证据相对明确，研究结果提示，在未来临床使用TLK199时应注意预防患者骨质疏松症的发生。此外，GSTP1靶向激动剂和重组蛋白在骨质疏松症和一些破骨细胞相关的免疫和代谢性疾病中的临床应用也值得进一步探索。

转自：“朗盟医学”微信公众号

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