英文原题：Characterization, Directed Evolution, and Targeting of DNA Virus- Encoded RNA Capping Enzymes Using Phenotypic Yeast Platforms
供稿人：秦珊 北京大学
大家好，今天为大家介绍一篇ACS Chemical Biology文章，题目为“Characterization, Directed Evolution, and Targeting of DNA Virus- Encoded RNA Capping Enzymes Using Phenotypic Yeast Platforms”，文章的通讯作者是来自伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校大学的Angad P. Mehta教授。
人畜共患病毒的出现对人类健康、世界经济和世界粮食供应构成重大威胁。在这样的情形下，我们需要开发广谱治疗策略来对抗这些新出现的病原体。我们以往的策略是针对病毒复制和传播所必需的机制来开发广谱疗法，这些疗法也可以很容易地用于对抗新出现的人畜共患病原体。由于病毒RNA加帽酶对病毒复制和发病机制的重要性，以及它们均在DNA和RNA病毒中存在，这些病毒蛋白一直以来都是治疗靶点。
在这篇文章中，作者利用先前开发的一种基因组测序信息和基于酵母的平台(YeRC0M)来识别、表征和靶向来自新出现的DNA病毒株(即猴痘病毒和非洲猪瘟病毒)的病毒基因组编码的必需RNA加帽酶。简而言之，如图1所示，YeRC0M平台是由从酿酒酵母(S. cerevisiae)的二倍体菌株开始，其中II号染色体副本之一上的必需基因abd1 (N7-MTase)被G418抗性标记取代。该菌株用组成型表达abd1并具有ura3选择标记的质粒(pMO1)进行转化。接下来，进行孢子形成/发芽以分离酿酒酵母单倍体菌株，该菌株在II号染色体上缺失abd1，但含有用于表达必需基因abd1的pMO1。当质粒pMO1被消除(向生长培养基中添加5-氟乳清酸，5-FOA)时，由于缺乏abd1的表达，此类菌株(YeRC0M菌株)无法生长。
图1. YeRC0M平台示意图
于是作者希望利用这个平台对以对从上述生物信息学分析中识别出的MPV RNA加帽酶进行功能表征。在图2中，作者主要对MPV vD1和vD12的相互作用在RNA加帽过程的作用以及二者相互作用的功能motif进行研究。作者首先以MPV为研究对象，利用生物信息学手段从现有的MPV株中寻找潜在的MPV RNA加帽酶。作者构建了质粒pMO41和pMO42，分别用于他们前期寻找的潜在靶点——MPV vD1和MPV vD12的组成型表达。然后，用pMO41和pMO42转化该菌株，发现MPV vD1 (pMO41)和vD12 (pMO42)的共表达可以在5-FOA存在的情况下恢复S. cerevisiae abd1::kanMX4 pMO1单倍体生长。这表明功能性MPV vD1/vD12共表达单独能够弥补该菌株中abd1表达的缺失。因为MPV vD1和vD12之间的相互作用使其发挥作用，于是作者又对MPV vD1中发挥功能进行相互作用的motif进行研究。作者首先对二者之间的相互作用进行建模，基于模型，对MPV vD1进行突变后，再次利用YeRC0M平台进行筛选，发现这三种突变都使得酿酒酵母停止生长。因此，作者总结，在MPV(DNA病毒)中，包含三个独立结构域的单个加帽酶(vD1)可以在变构激活剂vD12存在的情况下执行有效的RNA鸟嘌呤-N7甲基转移酶，而在冠状病毒科中，这三种酶则三个独立的基因并在体内形成复合物以行使功能。
图2. 利用YeRC0M平台进行MPV vD1/vD12及vD1不同突变形式的催化功能活性
作者接下来研究是否可以使用YeRC0M来识别MPV中RNA加帽酶的新失活突变和减毒突变 RNA加帽酶。作者首先制作了MPV RNA vD1的模型(SWISS-MODEL)，并将其覆盖在VACV vD1上，以识别MPV活性位点中潜在的重要残基。作者首先构建vD1的变体，其中包含辅酶AdoMet结合位点附近的突变。利用YeRC0M来判断vD1突变对其功能的影响，结果发现，如图3，作者测试的5种突变组合均不具备野生型vD1/vD12相互作用的生物学功能，是失活突变。
图3. 利用YeRC0M平台进行MPV vD1不同突变位点的失活突变功能验证
作者同时在另外5中vD1突变组合中发现缓慢的酿酒酵母生长，如图4所示，由OD600生长曲线可以读出，这五种突变(vD1 R655A, vD1 Y555F, vD1 D545A, vD1 R548A, vD1 R655L)，作者由此结果判断这5种突变为减活突变。作者之后还利用这个模型筛选了vD1的减活突变，发现Y683V和R548K同样具有相当的减活毒性。本研究中鉴定的MPV vD1减毒变种可用于开发MPV减毒活疫苗。到这里，作者的生化分析和MPV vD1定向进化的结果证明了体内真核系统能够研究、进化和靶向新兴致病性DNA病毒的RNA加帽酶的能力。也正如这里所证明，基于细胞的数据通常与体外测定不同，作者提示，这可能对新出现的MPV毒株疫苗开发策略产生重大影响。
图4. 利用YeRC0M平台进行MPV vD1不同突变位点的减活突变功能验证
接下来，作者进一步将平台扩展到了ASFV，一种高度传染性的病毒，会导致猪出现病毒性出血性疾病，死亡率很高。ASFV的RNA加帽酶与MPV的D1亚基具有相似的结构域，由具有RNA三磷酸酶、鸟苷基转移酶和N7-甲基转移酶活性的三个结构域组成。然而，尽管ASFV和MPV都是在细胞质中复制的双链DNA病毒，但它们编码的RNA加帽酶却有不同。ASFV加帽酶(NP868R)的N7-MTase结构域与VACV vD1的N7-MTase结构域之间的序列相似性仅为∼20%。作者进一步通过设计YeRC0M0衍生平台来功能表征ASFV NP868R N7-Mtase活性。为此，作者构建了编码与人类mce1基因融合的WT ASFV NP868R基因的质粒pAT15。如图5所示，酿酒酵母在5-FOA存在下生长48小时，表明由于ASFV NP868R的表达，成功实现了正常生长。
作者之后对ASFV NP868R N7-Mtase进行生化表征，以鉴定ASFV NP868R中的重要残基和减毒突变。为了实现这一目标，作者首先进行了基于结构的合理诱变，以了解ASFV NP868R N7-MTase结构域活性位点中各种氨基酸的作用。之后设计了一系列突变位点，成功鉴定到失活以及减活突变(图5)。
图5. 利用YeRC0M平台进行ASFV NP868R N7-Mtase不同突变位点的失活及减活突变功能验证
为了开发小分子抑制剂选择性靶向病毒RNA加帽酶而不是人类RNA加帽酶的广谱抑制剂，作者接下来依然利用YeRC0M筛选策略，将YeRC0M扩展到人类RNA加帽酶，实现选择性广谱抑制剂的筛选。与pMO2类似，作者构建了表达人RNMT-MCE1融合体的质粒pMO5，并将其转化到S. cerevisiae abd1::- kanMX4 pMO1单倍体中，以产生S. cerevisiae abd1::kanMX4 pMO2 pMO5单倍体。如图6所示，S. cerevisiae abd1::kanMX4 pMO1 pMO5单倍体能够在5-FOA存在下存活，表明这种基于酵母的筛选与人类RNMT兼容，可用作筛选的表型平台，用以进行选择性病毒RNA加帽酶抑制剂的筛选。
图6. 利用YeRC0M平台进行广谱病毒RNA加帽酶抑制剂筛选
总的来说，这篇文章对病毒RNA加帽酶及其必需的蛋白质结构域进行了鉴定和生化表征；利用定向进化，筛选出病毒RNA加帽酶的失活和减毒突变，这些数据有助于减毒活疫苗的开发；开发了有助于高通量表型筛选的方法，以鉴定选择性靶向病毒RNA加帽酶而不是宿主RNA加帽酶的广谱抑制剂。作者开发的YeRC0M筛选策略是高度模块化的，可用于多种病毒RNA加帽酶的筛选鉴定，为未来有可能出现的新型病毒的抑制剂开发提供了一个很好的平台。
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
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