细胞命运可塑性是一个重要的科学问题。利用过表达转录因子或使用化学小分子组合等策略，可以将已分化的体细胞逆转为诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cell, iPSC），这一技术被称为体细胞重编程【1-13】。相较于转录因子，小分子具有易于操控、不插入基因组、处理可逆等优点；因此，使用纯粹小分子组合的化学重编程是一种研究细胞命运可塑性的重要体系。干细胞化学生物学做为新兴交叉学科，利用小分子体外及在体精准调控干细胞命运、状态、功能等，在基础研究、抗衰老、抗肿瘤、再生医学等领域具有广泛应用前景，化学重编程是其焦点之一。然而，目前已报道的化学重编程体系在速率上与传统转录因子重编程存在差距，仍有较大提升空间；化学重编程在分子轨迹上与转录因子重编程存在较大差异，说明化学重编程机制上的独特性；目前化学重编程过程的具体分子机制极不清晰，有待深入发掘。
2023 年 8 月 7 日，浙江大学生命科学研究院祝赛勇实验室在 Nature Cell Biology 发表题为 A fast chemical reprogramming system promotes cell identity transition through a diapause-like state 的研究论文，首次报道了细胞快速化学重编程（Fast chemical reprogramming, FCR）。该研究中作者致力于改造小鼠化学重编程体系，通过采取多种策略，筛选了 2 万多个条件，自主研发创建了 FCR，大幅度加快了细胞命运重塑进程，将原先约 40 天的过程缩短至 7-12 天，实现了最快 1 周的质的飞跃。在此基础上，利用多组学测序及整合分析，系统性地展现了 FCR 过程中的转录与表观遗传动态，并揭示 FCR 后期经历了一个独特的滞育类似状态。有意思的是，作者还发现了异染色质组蛋白修饰 H3K9me3 通过调控多能性相关内源性逆转录病毒 ERVs 从而作为重编程障碍的独特机制。FCR 过程中，细胞感受外源信号，克服重重障碍，「破茧成蝶」，华丽转身。
从解决化学重编程周期长、效率低等关键问题出发，博士生陈希独辟蹊径，采取了一个与以往研究不同的筛选策略，以最终生成 iPSC 效率为筛选指标，通过在化学重编程三个阶段分别筛选约 7000 个小分子，发现了一系列有效小分子可以显著提高重编程效率：第一阶段发现了 SR11237、CD3254 和 CCT129202，第二阶段发现了 TSA、TMP269、Citarinostat、 DMH1、AZD9291 mesylate 和 SGC-CBP30，第三阶段发现了小分子 Vc 和 WS6。进一步测试发现生长因子 mLIF、小分子 VPA 和 R406 的作用窗口期为 2 天，提示化学重编程过程可以细分到每 2 天一个阶段，具备进一步优化空间。
随后，综合运用小分子文库筛选、浓度测试、处理时长测试、单个小分子移除试验等手段，通过将有促进效果的小分子加入到化学重编程体系中并调整其浓度和处理时间，最终建立了 FCR。在 FCR 过程中，任何阶段任一小分子或生长因子的移除都会导致 iPSC 诱导效率的下降，说明这些小分子和生长因子对于高效率重编程的必要性。其中，关键多能性基因 Oct4 在重编程第 7 天就已经被激活，进一步说明了 FCR 的快速性。通过严格的细胞、分子和功能实验，作者证明了 FCR 产生的 iPSC 具有完备的多能性。这些实验证明了 FCR 是一个快速、高效、安全的不依赖外源转录因子进行多能性重编程获得 iPSC 的新体系。
那么，在 FCR 过程中细胞究竟发生了哪些翻天覆地的变化呢？为此，作者对整个 FCR 过程 8 个时间点取样构建了多组学文库，包括：RNA-seq、ATAC-seq、CUT&Tag (H3K27ac、H3K4me3、H3K18la、H3K27me3 和 H3K9me3) 和 RRBS，全面地探索了 FCR 过程中转录组与表观遗传组的动态变化。作者发现 FCR 与转录因子重编程在重编程路径上有明显差别，并进一步发现胚外内胚层相关的转录因子推动了两个重编程体系的路径差异。转录组分析结果发现，FCR 后期显著下调了核糖体、剪切体、DNA 复制相关基因，这一现象提示了 FCR 后期可能经历一种滞育类似状态。在小鼠中，滞育是一种由环境因素诱导的特殊囊胚状态，引起囊胚细胞增殖减缓甚至停滞，以及蛋白合成速率降低，并导致胚胎着床延后，这一特殊机制有助于后代的存活【14】。小鼠胚胎干细胞也可以通过例如抑制 mTOR 信号通路、Myc 基因敲除或饥饿等手段诱导一个滞育类似状态，处在该状态下的小鼠胚胎干细胞呈现出明显减缓的蛋白翻译和细胞增殖速率【15,16】。此外，一部分癌细胞也被发现通过进入胚胎滞育细胞的类似状态从而获得化疗抵抗能力【17】。然而，滞育类似状态是否也存在于体细胞重编程为 iPSC 的过程中仍未可知。本研究中，作者通过与体内滞育囊胚转录组数据比较以及相应实验证明了 FCR 在后期经历一种重编程中独有的滞育类似状态。
为了排除细胞异质性对 RNA-seq 结果的干扰，作者在 FCR 的第 0、4、8 和 12 天以及 iPSC 取样进行了 scRNA-seq 分析，发现 FCR 依次经历了成纤维细胞、上皮样细胞、中间态细胞、新生 iPSC 和 iPSC 阶段，从而实现细胞命运的逐步重塑。通过 SCENIC 分析和敲低实验，作者发现并证明了 Stat3 和 Sox7 是 FCR 的重要的中间态转录因子。利用拟时序分析，作者再次证明了滞育相关基因在 FCR 成功重编程途径后期细胞中的明显下调，并且通过敲低促进细胞进入滞育状态的关键的基因 Larp1、Slc17a5、Prkaa1 证明抑制滞育类似状态会导致 FCR 效率降低，说明滞育类似状态是 FCR 过程中一个重要的中间态，对于细胞内多能性网络的建立起关键作用。
接下来，作者继续抽丝拨茧，整合 ATAC-seq 和多种组蛋白修饰的 CUT&Tag 数据进行了联合分析，发现在 FCR 过程中，动态的染色质可及性位点大部分在 FCR 中呈现高度动态，伴随着相应组蛋白修饰的动态变化。即使细胞经历滞育类似状态，细胞核内仍发生着剧烈的表观遗传重塑。进一步在全基因组水平上，作者发现异染色质的标志性修饰 H3K9me3 在 FCR 过程中都富集于基因组上基因稀疏的区域，这些区域包含大量 ERVs。而在 FCR 过程中，ERVs 的表达模式也经历了一个逐步的从 MEF 向 iPSC 的动态变化，说明了 ERVs 可能也会参与并影响重编程过程。H3K9me3 已经被证明在多能干细胞中可以调控 ERVs，因此，作者筛选找到了 24 个受 H3K9me3 调控的 iPSC 相关的 ERVs【18】。iPSC 相关的 ERVs 上有经典 Oct4-Sox2-Tcf-Nanog 这一多能性转录因子的基序，说明这些 ERVs 可能参与到多能性网络的构建中。通过敲低和小分子抑制实验，作者证明对 H3K9me3 甲基转移酶的抑制可以促进 FCR，而敲低 iPSC 相关 ERVs 导致 FCR 效率降低。这些结果说明 H3K9me3 通过抑制 iPSC 相关的 ERVs 从而作为 FCR 的障碍。
图. 研究模式图
总的来说，这项研究采用新筛选策略开展大规模小分子筛选，发现了一系列可以促进化学重编程的小分子，并对这些小分子进行最优组合和浓度测试，自主研发了细胞快速化学重编程 FCR 新体系；利用多组学整合分析，系统描绘了 FCR 过程基因表达和表观遗传动态，发现 FCR 后期经历独特的滞育类似状态，并揭示 H3K9me3 通过抑制多能性相关 ERVs 从而阻碍 FCR（研究模式图）。有意义的是，该研究提供了一个高效快速的细胞化学重编程技术平台，并揭示了独特的细胞命运重塑机制，有助于研究者们进一步探索和理解细胞身份建立与维持的基本原理；该研究为化学重编程技术的临床应用——利用药物提高再生能力缺乏或较弱的组织的可塑性从而应用于再生医学或延缓衰老——提供了理论基础和技术支撑。
该研究得到了李伟教授、Professor Holger A. Russ、傅君芬教授、何向伟教授、赵小阳教授、王昊教授等的大力帮助。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41556-023-01193-x
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