骨质疏松症是一种慢性骨骼疾病，其特征是骨含量低和骨组织微观结构恶化，随之增加骨脆性和骨折的风险。在这种疾病的发展过程中，骨质疏松微环境中各种骨细胞、无机成分和免疫细胞之间功能紊乱的相互作用通常共同作用于形成最终的骨质疏松。目前对骨质疏松症的临床治疗主要针对破骨细胞的生物学特性，忽视了其它骨细胞、免疫细胞、细胞因子和无机成分在形成异常骨质疏松微环境中的协同作用。
北京时间8月2日，上海交通大学杨宇与苏州大学刘庄及其合作者在Science Advances上发表题为 “Metal-polyDNA nanoparticles reconstruct osteoporotic microenvironment for enhanced osteoporosis treatment”论文。该研究开发了由Ca2+和超长功能性单链DNA序列组成的金属-多聚DNA自组装纳米粒（Ca-polyCpG MDNs），用于重构骨质疏松微环境治疗骨质疏松症。Ca-polyCpG MDNs能够中和破骨细胞分泌的氢离子对骨骼的侵蚀，同时提供钙补充，促进骨损伤的重矿化和修复。此外，Ca-polyCpG MDNs中的免疫佐剂polyCpG能够诱导破骨细胞生成抑制因子IL-12的高分泌，降低破骨细胞功能效应蛋白的表达，从而抑制破骨细胞分化，进一步减少破骨细胞介导的骨吸收。有趣的是，在滚环扩增合成长单链DNA反应中生成的副产物PPi4-可作为双膦酸盐类似物，增强Ca-polyCpG MDNs对骨骼的靶向性（图1）。在卵巢切除小鼠和兔骨质疏松（OVX）模型中，Ca-polyCpG MDNs通过恢复骨质疏松微环境，抑制骨吸收并促进骨修复，为骨质疏松症治疗提供了新思路。
Ca-polyCpG MDNs中的长单链是由滚环扩增技术（RCA）制备得到，含有polyCpG的序列。在RCA过程后，加入CaCl2与polyCpG配合，形成金属-多聚DNA自组装纳米粒（MDNs）。多种表征手段显示，Ca-polyCpG MDNs具有单分散的形貌和多孔结构，且Ca和P元素在Ca-polyCpG MDNs中均匀分布。经过仔细计算，合成的Ca-polyCpG MDNs中DNA和Ca2+的负载效率分别为37.0%和21.7%（图1）。值得注意的是，长单链polyCpG相较于短链DNA结构具有更强的稳定性。
图1 Ca-polyCpG MDNs的制备与表征
成熟的破骨细胞粘附在骨表面，分泌大量氢离子（H+）酸化局部细胞外微环境，使骨的矿物相溶解，为有机基质降解提供了适宜的环境，是骨吸收的关键因素。鉴于酸化作用在破骨细胞骨吸收中的关键作用，Ca-polyCpG MDNs有望可以中和酸以抑制骨质疏松症。为了确认骨质疏松骨中的局部pH值以及破骨细胞介导的H+外分泌过程中Ca-polyCpG MDNs的细胞外耐酸性能，该研究通过DiI标记破骨细胞，评估了骨表面pH探针FITC（在低pH值下呈现荧光猝灭）的荧光强度变化。结果表明，在Ca-polyCpG MDNs的保护下，DiI和DAPI标记的破骨细胞粘附在骨表面时，明显的绿色荧光信号得到了很好的维持。相反，当破骨细胞被酸腐蚀时，FITC信号几乎消失（图2）。
羟基磷灰石（HAP, Ca10（PO4）6（OH）2）是骨组织的主要组成部分，在骨质疏松微环境中严重丢失。尽管现有研究已经开发了许多用于骨缺损修复的生物材料，但骨的特殊胶原纤维结构（例如只有1.8-4 nm的弯曲亚通道）限制了治疗效果。值得注意的是，该研究制备的Ca-polyCpG MDNs能够在酸性骨质疏松环境中分解，释放出游离Ca2+，能够更深的渗透到骨组织的胶原原纤维中，从而增强骨矿化（图2）。
图2 Ca-polyCpG MDNs中和酸及增强骨矿化。
先前的研究发现，利用CpG寡核苷酸激活巨噬细胞中的toll样受体9（TLR9）能够抑制RANKL诱导的破骨细胞形成。为此，该研究系统的评估了含有polyCpG的功能化Ca-polyCpG MDNs是否能够抑制破骨细胞分化和骨吸收活性。研究发现，Ca-polyCpG MDNs中的polyCpG能够通过促进IL-12的分泌，降低破骨细胞功能效应蛋白的表达，从而抑制破骨细胞分化，进一步减少破骨细胞介导的骨吸收。另外，该研究使用牛骨吸收试验评估破骨细胞吸收骨的能力，结果发现Ca-polyCpG MDNs处理后，破骨细胞对骨骼的吸收明显减弱（图3）。
此外，由于骨质疏松微环境中巨噬细胞的极化状态与破骨细胞的形成有关，该研究进一步探究了Ca-polyCpG MDNs对体内巨噬细胞极化的影响。结果显示，与游离CpG和阴性对照相比，Ca-polyCpG MDNs对巨噬细胞向M1表型（CD86+）极化的诱导作用最为显著（图3）。有趣的是，M2表型（CD206+）也增加了，而M1/M2的比例没有显著增加。这些结果与先前的研究一致，巨噬细胞在组织修复和骨重塑中起着关键作用，巨噬细胞释放的促炎细胞因子对早期骨折修复至关重要。另一方面，巨噬细胞虽能在一定程度上分化为破骨细胞，但单核细胞是破骨细胞最重要的前体细胞。因此，减少单核细胞的数量可能有利于减轻骨质疏松症。例如，有报道称CpG可以通过诱导TLR9信号通路的激活来减少破骨细胞的数量，从而引导BMM前体向M1巨噬细胞谱系而不是破骨细胞谱系发展。还应注意的是，并非所有M1巨噬细胞都能分化为破骨细胞;某些条件，如IL-4的存在，是发生这种分化过程所必需的。
图3 Ca-polyCpG MDNs抑制破骨细胞的分化、活化和骨吸收。
PPi4-作为一种双膦酸盐类似物，对骨组织具有很强的亲和力。在Ca-polyCpG MDNs制备过程中产生的PPi4-可能有助于增强Ca-polyCpG MDNs在骨组织中的保留。在体外，该研究发现Ca-polyCpG MDNs在骨组织中的滞留率高于没有PPi4-的Ca-DNA。另外该研究对Ca-polyCpG MDNs的体内药代动力学进行了检测，结果表明，Ca-DNA的第一和第二半衰期分别为0.13±0.03 h和4.4±0.7 h, Ca-polyCpG的第一和第二半衰期分别为0.43±0.07 h和4.9±2.3 h。另外，通过静脉给药，Ca-polyCpG MDNs在骨组织中的荧光信号明显强于不含PPi4-的Ca-DNA，表明PPi4-的骨亲和性以及Ca-polyCpG MDNs在骨质疏松骨中的明显靶向和滞留能力。综上所述，随着循环时间的延长和PPi4-对骨组织的高亲和力，Ca-polyCpG MDNs可以有效靶向骨组织，并在骨质疏松的骨骼中长期滞留（图4）。
该研究接下来，分别采用了局部给药和系统给药的方式，探究Ca-polyCpG MDN在去卵巢小鼠（OVX）骨质疏松模型中的抗骨质疏松作用。通过使用micro-CT，TRAP染色，HE染色，钙黄绿素双标检测，以及三点弯曲试验等系统的实验，该研究证明Ca-polyCpG MDN可以显著缓解小鼠骨质疏松的症状，有效增强骨骼强度和抗骨折性（图4）。
图4.Ca-polyCpG mdn在OVX小鼠模型中的抗骨质疏松作用。
除OVX小鼠模型外，本研究还在OVX兔模型中评估了Ca-polyCpG MDNs对骨质疏松症的治疗效果。同样的，在兔子体内，Ca-polyCpG MDNs显示出良好的抗骨质疏松的能力（图5）。
图5. Ca-polyCpG MDNs在OVX兔子模型中的抗骨质疏松作用。
骨质疏松症是一种以异常的骨微环境为特征的骨疾病，涉及多种细胞类型、无机成分、物理化学性质和信号分子。这种疾病的复杂性使得传统的单一功能材料难以治疗。在这项研究中，作者提出了一种治疗骨质疏松症的新方法，利用钙-多聚DNA自组体Ca-polyCpG MDNs）来调节骨疏松微环境治疗骨质疏松，为骨质疏松的临床治疗提供了新的思路。
【作者简介】
杨宇，上海交通大学医学院分子医学研究院研究员、博士生导师。国家级青年人才和上海市青年人才计划入选者。长期在生物材料、DNA分子与纳米工程、免疫工程等交叉学科领域从事研究，近年来针对肿瘤等重大疾病的诊疗，发展了一系列基于DNA分子与生物材料的光学治疗、放射治疗、靶向治疗与精准免疫治疗新策略。以第一或通讯作者在Sci. Adv.（2篇）、Chem、J. Am. Chem. Soc.（2篇）、Angew. Chem. Int. Ed、Adv. Mater.、Nano Lett.（3篇）、ACS Nano（3篇）、ACS Cent. Sci.（2篇）、 Biomaterials（2篇）等国际高水平学术刊物上发表SCI文章40余篇。论文总引用4600余次，H因子34，多篇论文入选 “ESI高被引论文” 。获得澳门科技奖研究生科技研发奖（2018）、Baxter China青年研究者奖一等奖（2019）。担任Nano Micro Letters、Exploration和AJPS等期刊青年编委。
刘庄，苏州大学教授，博士生导师，国家杰出青年基金获得者，教育部长江学者特聘教授。近年来在生物材料与肿瘤纳米技术领域从事研究，围绕肿瘤诊疗中的若干挑战性问题，发展了一系列新型纳米探针用于体外生物检测与活体分子影像，并探索了多种基于纳米技术和生物材料的肿瘤光学治疗、放射治疗、与免疫治疗新策略。共发表学术论文320余篇，论文总引用超过60,000次，SCI H-index = 134。2014年起连续入围Elsevier出版社发布的“中国高被引用学者榜单”（材料科学类）；2015年起连续入选美国美国科睿唯安（原汤森路透集团）公布的“全球高被引科学家名单”（Highly Cited Researchers）。
原文链接：
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adf3329
来源：课题组供稿
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