ACS Chem. Biol. | 针对产生烯二炔抗生素条件的FRET-高通量筛选

英文原题：Targeted Discovery of Cryptic Enediyne Natural Products via FRET-Coupled High-Throughput Elicitor Screening

供稿人：曹孟睿 北京大学

大家好，今天为大家介绍一篇 ACS Chemical Biology 文章，标题为“Targeted Discovery of Cryptic Enediyne Natural Products via FRET-Coupled High-Throughput Elicitor Screening”，文章的通讯作者是来自普林斯顿大学的Mohammad R. Seyedsayamdost教授。在这项工作中，作者团队利用基于FRET的DNA断裂reporter assay筛选到引起带小棒链霉菌产生烯二炔抗生素的小分子，并通过质谱鉴定到烯二炔的环芳烃化代谢产物。作者团队最终在生物合成基因簇中找到了对烯二炔表达至关重要的clv基因。

烯二炔抗生素可以剪切双链DNA且其基因在微生物的生物合成基因簇中存在。然而，在正常培养条件下这些烯二炔抗生素并不被表达，使得对烯二炔的发现较为困难。作者利用烯二炔能剪切DNA的特性，首先基于FRET利用DNA被剪切产生的荧光信号，通过小分子库高通量筛选出产生烯二炔的条件，并通过HPLC-MS检测到烯二炔的卤化产物以及heptaene代谢产物（图 1）。

图1. 基于FRET高通量筛选引起DNA剪切的条件

作者发现以类固醇为主的一部分小分子可以产生DNA切割的荧光信号以及烯二炔的卤化产物的质谱信号。HPLC-MS检测到烯二炔卤化物的异构体，且同位素信号符合烯二炔一氯化的修饰。这对异构体1：1的信号符合烯二炔在生成类苯二自由基后分别在不同位置被卤化。

图2. 引起烯二炔代谢物产生的小分子

因为类固醇被发现为最佳的烯二炔诱导条件，因此作者通过类固醇分子诱导烯二炔的表达并发现卤化代谢物随着类固醇浓度的提高而增加。同时质谱也检测到代谢物heptaene的生成，且UV-Vis证明代谢物的产生与类固醇诱导浓度呈正相关性。因此，作者证明了类固醇的确可以诱导烯二炔的生成，进而剪切DNA并产生烯二炔代谢物（图3）。

图3. 类固醇引起烯二炔卤化物以及代谢产物的生成

为了鉴定卤化代谢物的结构，作者大量诱导并纯化出卤化代谢物。通过HR-MS以及NMR HMBC、COSY、ROESY分析解出烯二炔卤化代谢物的具体结构。异构体的NMR图谱也在除氯苯信号外高度一致。作者同时也鉴定到其他分子量的烯二炔卤化物的异构体，并通过上述分析方法确定了其对应的结构（图4）。

图4. 烯二炔异构卤化物的具体结构

通过HR-MS/MS，烯二炔其他的卤化代谢物均被搜索到并对应其可能的结构。这些卤化代谢物在基于FRET的检测中均不能剪切DNA，因此作者通过其结构推测出具有DNA剪切活性的九圆环烯二炔前体。最终。作者通过替换BGC中表达糖基转移酶与硫酯酶的clv基因，发现烯二炔的卤化物不再被表达，证明clv基因对烯二炔的生成至关重要（图5）。

图5. 烯二炔代谢物与其生物合成位点的鉴定

综上所述，作者基于FRET检测引发DNA断裂的小分子条件为类固醇，并对烯二炔的多种代谢物进行了表征且基于结构推测出对应的烯二炔活性前体。此研究有助于增加烯二炔的发现，并为将来识别其他烯二炔的种类提供了蓝图。

转自：“ACS美国化学会”微信公众号

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