论文信息：Peng Zhang, Yesheng Jin, Wei Xia, Xiaotong Wang, Zhiqiang Zhou, Phillygenin inhibits inflammation in chondrocytes via the Nrf2/NF-κB axis and ameliorates osteoarthritis in mice, Journal of Orthopaedic Translation 41, 1-11, 2023
研究背景：骨关节炎广泛见于老年人，以软骨退化、软骨下骨重塑和滑膜炎症为特征。目前，办公自动化的发展还没有治愈的办法。连翘素(Phillygenin，PHI)是连翘子中的有效成分，在多种疾病中具有抗炎、抗氧化等多种生物学活性。然而，PHI对骨性关节炎的潜在影响和潜在机制仍不清楚。
研究发现：本研究发现PHI抑制IL-1β诱导的原代小鼠软骨细胞促炎细胞因子的产生和细胞外基质的降解。在机制上，PHI通过激活核因子(红素衍生的2)样2(NRF2)抑制了核因子-κB途径。体内实验也证实了PHI对DMM小鼠模型的软骨保护作用。
转化意义：这项研究为使用PHI作为治疗OA的潜在候选药物提供了生物学基础。
图一：PHI对原代小鼠软骨细胞活力的影响。PHI的化学结构如图1所示。在软骨细胞中加入不同浓度(0、5、10、20、40、80μM)的PHI，分别培养24 h和48 h，用CCK8比色法检测细胞活力。如图1B和图1C所示，在24小时和48小时内，Phi(<40μM)是无毒的。因此，这些浓度的Phi被用于以下实验。如图1D所示，原代小鼠软骨细胞在光镜下观察到IL-1β刺激后细胞数量减少，而PHI(20μM)作用24 h则逆转了这一作用。
图二：PHI抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡和ROS的产生。观察PHI(20μM)对软骨细胞凋亡和ROS生成的影响。结果显示，IL-1β增加了Annexin V的阳性比率(图2A和B)，表明细胞凋亡被激活。此外，线粒体去极化(图2C和D)和ROS产生(DCF强度增加，图2E和F)有效地增强了对IL-1β的刺激。相比之下，PHI治疗明显减轻了这些变化(图2A-F)。提示PHI对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡和ROS的产生具有有效的保护作用。
图三：PHI改善IL-1β诱导的软骨细胞炎性细胞因子的产生。软骨细胞经IL-1β(10 ng/ml)刺激后，加入PHI(0，5，10，20，40 ngM，24 h)处理。PCR图(图3A-D)和Western blotting(图3E)结果显示，IL-1β刺激后，NOS2、IL-6、PTGS2和肿瘤坏死因子的基因表达水平以及诱导型一氧化氮合酶和环氧化酶-2的蛋白水平均增加，而PHI则以浓度依赖的方式逆转这些变化。此外，细胞悬浮液中的NO浓度通过Griess反应检测(图3F)通过酶联免疫吸附试验试剂盒(图3G-I)检测IL-6、PEG2和肿瘤坏死因子-α的水平。结果表明，IL-1β可诱导NO、IL-6、PEG2和肿瘤坏死因子-α的表达上调，PHI以剂量依赖的关系可以下调IL-1β刺激的软骨细胞炎性细胞因子的表达。
图四: PHI抑制IL-1-β诱导的软骨细胞外基质降解。Western blotting结果显示，IL-1β可下调II型胶原和蛋白聚糖的生成，上调ADAMTS5和MMP13的表达。相反，PHI处理浓度依赖地逆转了这种变化(图4A-E)。II型胶原和基质金属蛋白酶-13的免疫荧光结果也得到了类似的结果(图4F和G，PHI20μM)。因此，提示PHI可抑制IL-1β诱导的软骨细胞外基质降解。
图五：PHI抑制IL-1β诱导的软骨细胞NF-κB途径并激活NRF2途径。Western blotting结果(图5A-C)显示，IL-1β显著促进胞浆IκBα的降解，并上调核p65的表达。然而，PHI治疗以剂量依赖的方式显著抑制上述变化。提示phi可抑制IL-1κ激活的小鼠软骨细胞中的NF-βB通路。此外，此前已有大量研究集中于Nrf2通路在骨性关节炎中的重要性。在本研究中，在IL-1β刺激下，小鼠软骨细胞中NRF2和HO-1的表达没有显著变化，而PHI增加了NRF2的核转位和胞浆中HO-1的表达(图5D-F)。此外，HO-1免疫荧光结果(图5G，PHI20μM)在IL-1β刺激后没有明显变化。但可观察到HO-1在细胞质中高表达，这与Western blotting结果一致。这一发现揭示了PHI可以增强小鼠软骨细胞中的Nrf2信号。
图六：NRF2介导PHI对软骨细胞中NF-κB的抑制作用。为检测Nrf2是否能激活NF-κB信号通路，采用shRNA法下调软骨细胞中Nrf2的表达(“sh-Nrf2”)，并用慢病毒干扰对照shRNA(“sh-C00”)转导对照细胞。Western blotting结果(图6A-D)显示，sh-Nrf2转基因显著抑制了细胞核Nrf2和胞浆HO-1的产生。相反，sH-Nrf2转染后p65核表达显著上调。检查线粒体去极化结果(图6E和图F)显示，PHI抑制IL-1β诱导的线粒体去极化，而这种现象被sh-Nrf2基因转染所抵消。综上所述，这些结果证明了NRF2介导了PHI诱导的对NF-κB信号的抑制。
图7：Phi挽救了DMM模型小鼠骨关节炎并促进Nrf2的表达。为探讨phi对小鼠骨性关节炎的保护作用，采用DMM建立骨性关节炎小鼠模型，分别以0.5%羧甲基纤维素组和20 mg/kgPHI+0.5%羧甲基纤维素组给药，连续灌胃8周。骨性关节炎的组织学分析采用HE和番红O染色(图7A)。与假手术组相比，DMM组软骨侵蚀严重，蛋白多糖含量减少。DMM组软骨表面光滑，蛋白多糖含量高于DMM组。与染色结果一致的是，DMM组OARSI评分高于Sham组，而DMM + PHI组OARSI评分低于DMM组(图7b)。此外，图7C-E免疫组织化学染色显示DMM组P65的表达高于假手术组，而P65在DMM组的表达下调。此外，与DMM组相比，DMM组的Nrf2表达显著增加，p65表达显著降低(图7C-E)。免疫荧光染色(图7F和G)显示DMM组软骨细胞核中Nrf2的表达水平显著高于DMM组。综上所述，这些结果证实了PHI通过NRF2/NF-κB途径缓解了骨性关节炎的发生。
图8.PHI通过激活NRF2和抑制NF-βB途径来保护软骨细胞免受IL-1κ诱导的炎症和细胞外基质降解。
课题组简介：张鹏博士，苏州大学附属第二医院副主任医师，硕士生导师。主要从事脊柱和创伤外科的临床诊疗工作。课题组主要对退变性/特发性脊柱侧弯和先天性脊柱侧弯的矫形、四肢和脊柱创伤、感染（结核、骨髓炎）及骨质疏松等疾病有较深入的研究。
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