英文原题：Discovery of Class I Diterpene Cyclases Producing a Tetracyclic Cephalotane in Plum Yews
通讯作者：王勇、孙雨伟，中国科学院分子植物科学卓越创新中心
作者：Yaping Mao (毛亚平), Guangyi Wang (王光义), Jianhua Li (李建华), Zhanguang Feng (冯占广), Yuhong Ren (任宇红)
二萜环化酶（DiTPS）是二萜类化合物骨架形成过程中的关键催化酶，通常以香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）为前体合成具有20个碳的环状母核结构。在裸子植物中，普遍具有由对映-柯巴基焦磷酸合酶（ent-CPS）和对映-贝壳杉烯合酶（ent-KS）共同介导的植物激素赤霉素（GA）合成途径（Figure 1）。松科植物的二萜树脂酸（DRA）合成则由双功能左旋海松二烯合酶（LAS）或异海松二烯合酶（Iso）等介导。在少数的裸子植物中，发展出了一类特异性的二萜次生代谢产物，例如红豆杉属、金钱松来源的紫杉醇、土荆皮乙酸等，该类萜类化合物的骨架前体由单功能I型DiTPS直接催化GGPP生成（Figure 1）。
Figure 1. Diterpene metabolism in gymnosperms. Solid arrows indicate steps catalyzed by verified diTPSs and oxidases (Ox). Dashed arrows indicate unidentified steps. In general metabolism, the phytohormone GAs essential to plant growth and development are biosynthesized by ent-CPS, ent-KS, and Ox decorating the kaurene core. Pinaceae plants have evolved bifunctional class I/II enzymes that form the core of various labdane-related DRAs. In yews (Taxus) and golden larch (Pseudolarix amabilis), monofunctional class I diTPSs like taxadiene synthase (TXS) and pseudolaratriene synthase (PxaTPS8) convert GGPP to the precursor for taxoids and pseudolarates, respectively. On the other hand, the diterpene synthase(s) responsible for the biosynthesis of cephalotane diterpenoids remain(s) completely unknown.
三尖杉科三尖杉属（Cephalotaxus）植物同样能够产生一类特异性的二萜产物，被称为三尖杉烷型二萜。近年来，该类二萜因具有独特复杂的碳骨架和显著的抗肿瘤活性而受到研究者的广泛关注。例如从海南粗榧中发现的海南粗榧内酯（harringtonolide）具有优异的抗肿瘤和抗病毒活性，对KB肿瘤细胞毒性IC50达到43 nM。目前为止，三尖杉二萜主要来源于植物提取，然而作为雌雄异株的裸子植物，三尖杉属植物不易繁殖，生长周期缓慢，分布区域有限。三尖杉烷型二萜在植物叶组织中的含量普遍低于0.01%干重，因此亟需寻找可再生的获取途径以降低对于植物资源的依赖和破坏。随着合成生物学技术的快速发展，以天然产物生物合成途径解析为基础，利用合成生物学手段实现活性天然产物的异源合成对于摆脱原生植物资源限制、扩展化合物来源具有非常重要的意义。然而目前为止，关于三尖杉烷型二萜类化合物的生物合成途径解析未见报道，使得其异源生物合成受到限制。
近日，中国科学院分子植物科学卓越创新中心王勇研究员团队在ACS Catalysis上发表了题为“Discovery of Class I Diterpene Cyclases Producing a Tetracyclic Cephalotane in Plum Yews”的研究文章。该论文报道了三尖杉属植物二萜生物合成途径的关键萜类环化酶，揭示了三尖杉烷型二萜前体骨架三尖杉-12-烯的生物合成过程，为裸子植物二萜代谢多样性的起源和演化提供了深入见解。
在本研究中，我们首先通过挖掘柱冠粗榧（Cephalotaxus harringtonia）的转录组数据，推测了二萜代谢相关的萜类环化酶候选基因CharTPS1-7（Figure 2）。我们选择了68条裸子植物来源的已知功能DiTPS与CharTPS1-7进行系统发育分析，其中3个候选环化酶（CharTPS4、CharTPS5和CharTPS6）含有DxDD基序（Figure 2A），并与其他裸子植物的II型DiTPS聚类。其余四个候选环化酶（CharTPS1、CharTPS2、CharTPS3和CharTPS7）具有保守的DDxxD和NSE/DTE基序（Figure 2A），初步鉴定为I型DiTPS。根据系统进化分析，ChTPS4和ChTPS2与已知的裸子植物ent-CPS（如TcTPS3、PtCPS1）和ent-KS（如TcKSL8、PtKS1）具有亲缘关系（Figure 2B），表明它们可能参与对映-贝壳杉烯的生物合成。ChTPS5和ChTPS6与产生(+)-CPP和LPP的裸子植物II型DiTPS（如TcCPS2、TcCPS4和TpTPS3）关系最为密切，而CharTPS1和CharTPS3与多个I型DiTPS聚类（Figure 2B），推测能够将(+)-CPP或LPP转化为相应二萜骨架。CharTPS7与已知的单功能I型DiTPS紫杉二烯合酶（TXS）聚集在同一分枝（Figure 2B），转录测序表明CharTPS7在柱冠粗榧的针叶中具有高表达，因此我们推测其最有可能参与三尖杉烷型二萜（主要积累于针叶中）的生物合成。
进一步，我们运用本氏烟草瞬时表达体系和重组蛋白体外酶促反应两种方式对候选酶基因进行了功能验证，结果表明：CharTPS2与CharTPS4分别为ent-CPS和ent-KS，参与赤霉素前体对映-贝壳杉烯（ent-kaurene，化合物1）的合成；CharTPS5和CharTPS6为(+)-CPS，其产物(+)-CPP在CharTPS1的催化下生成biformene（化合物2）（Figure 3A，B）。CharTPS7及其海南粗榧来源的同源蛋白ChaiTPS7能够直接催化GGPP生成一种未知的二萜母核（化合物3，分子离子峰m/z 272）（Figure 3A，C）。我们通过在本氏烟草中过表达CharTPS7，大量制备了化合物3用于结构鉴定。基于一维和二维核磁波谱，确定化合物3的结构为三尖杉-12-烯（cephalot-12-ene），该化合物具有罕见的7-6-6-5四环骨架结构（Figure 3D），这一结果推翻了之前关于三尖杉烯母核结构的假设（Phytochemistry. 2021, 192, 112939. Nat Prod Rep. 2012, 29, 845-869.）。
Figure 2. Discovery of diTPSs in C. harringtonia. (A) Multiple sequence alignment of seven CharTPSs. Signature motifs of class I (DDxxD) and class II (DxDD) cyclases are shadowed in sky blue and gray, respectively. (B) Phylogenetic analyses of CharTPS1-7 (marked in red) and reported gymnosperm diTPSs. The bifunctional PpCPS/KS from Physcomitrella patens is used as the outgroup.
Figure 3. Functional characterization of diTPSs in C. harringtonia. (A) Identified diterpenoid biosynthetic pathways in C. harringtonia. (B) GC-MS analyses of labdane-related diterpenes 1 and 2 produced by CharTPSs expressed in N. benthamiana leaves. (C) GC chromatogram and HRMS spectrum of cephalot-12-ene (3) produced by CharTPS7 in the N. benthamiana-based in vivo assay and in vitro enzymatic reaction. (D) Structure of 3. Identification was based on NMR measurements revealing key HMBC, H−H COSY, and NOE correlations.
为了深入理解CharTPS7（三尖杉-12-烯合酶，CS）催化的级联环化反应，我们运用同位素示踪并结合量子化学计算推测了三尖杉-12-烯的形成机制（Figure 4）。我们首先将异源甲羟戊酸途径整合至大肠杆菌BL21(DE3)菌株的染色体以保证充足的DMAPP和IPP前体供应（Figure 4A），共表达GGPPS和CharTPS7，并在培养基中添加[1-13C]乙酸钠后，通过13C核磁共振观察到了C2、C4、C6、C8、C10、C12、C14和C20位的信号增益。结合量子化学计算，我们推测了三尖杉-12-烯的形成过程（Figure 4B，C）：首先，DMAPP和IPP在GGPPS的催化下生成GGPP。进一步，CharTPS7通过Mg2+稳定结合GGPP并触发焦磷酸基团的离去，产生高活性碳正离子A，该阳离子的C1与C14-C15的π键之间通过分子内阳离子-π相互作用产生大环阳离子B（cembren-15-yl+）。在阳离子B中，C11-C15键的形成产生第一个具六元环的中间体阳离子C（verticillen-12-yl+）。上述碳正离子级联反应与TXS催化GGPP生成轮枝三烯（verticillene）和紫杉二烯（taxadiene）等前体的步骤一致。随后，CharTPS7与TXS生成不同产物的途径分化在于第二个六元环的形成（Figure 4B）。阳离子C发生分子内质子（H11）转移生成阳离子D（verticillen-11-yl+），进而促发C17甲基迁移生成阳离子E（phomacten-15-yl+）。阳离子E的一步质子转移（H20→H7）或两步质子转移（H20→H3→H7）均能够产生阳离子G，量子化学计算支持H20→H7的一步质子转移方式在能量上更为合理。进一步，阳离子G的C8与C15-C20的π键经分子内相互作用形成具有第二个六元环的阳离子H。阳离子H的分子内质子转移产生不稳定的二级碳正阳离子H’,引发C9-C11键的生成，形成分子内5-7双环。最终，阳离子I通过脱质子终止级联反应，生成终端产物三尖杉-12-烯（Figure 4B）。
为了进一步深入研究CS的催化机制，我们使用Robetta对CharTPS7的蛋白结构进行了预测，将底物GGPP与活性口袋进行分子对接后，我们发现DDxxD和DTE/NSE催化活性基序附近的两个芳香族氨基酸F625和W768可能影响CharTPS7的催化特异性（Figure 5A）。多序列比对显示W768特异性地存在于TXS和CS中，而F625是CS的特征性位点（Figure 5B）。将F625进行定点突变后，CharTPS7的突变体能够产生一系列具有二环结构的轮枝三烯和具有三环结构的紫杉二烯产物（Figure 5C，化合物4~8），根据这一结果我们推测F625可能参与阳离子C→D→E（verticillen-12-yl+→verticillen-11-yl+→phomacten-15-yl+）的转化，对于后续环化形成终端产物三尖杉-12-烯至关重要。F625的突变可能影响CS与verticillen-12-yl+的结合，将级联反应通路从“三尖杉烷特异性”环化步骤切换至生成verticillen-4-yl+（产生化合物4和8），verticillen-8-yl+（化合物5的前体），或通过“过早脱质子化短路”形成化合物6和7（Figure 5C）。
Figure 4. Proposed biogenesis of the cephalot-12-ene skeleton. (A) E. coli strain was engineered to facilitate the feeding of 13C-labeled precursors and large-scale preparation of 3. Sky-blue bold lines indicate the intact acetate units. Red squares indicate the 13C-labeled C1 of acetate. (B) Plausible CS-catalyzing cyclization cascade from GGPP to the tetracyclic scaffold of 3. Carbon numbers are indicated in different colors according to the original numbering systems for GGPP (in green), cembrene/verticillene/phomactene (in black), and cephalotane-type diterpenoids (in brown). Dashed arrows indicate an alternative route from cation E to G. (C) Relative energies for the conversion of geranylgeran-1-yl+ (cation A) to cation I. The energy was relative to cation A in kcal/mol.
Figure 5. Identification of crucial Phe625 in CharTPS7. (A) Protein structure of CharTPS7 was predicted by Robetta and docked with GGPP, revealing key residues in the substrate binding pocket. (B) Multiple sequence alignments of CharTPS7 with related TPSs. The conserved DDxxD and NSE/DTE motifs are indicated in gray. Details of the TPSs used are listed in Table S2. (C) EIC of the products produced by the CharTPS7F625V mutant, wild-type (WT) CharTPS7, and TXS in E. coli hosts. Wild-type CharTPS7 catalyzes the cyclization from verticillene-12-yl+ (cation C) to 3 (brown arrows), while compounds 4−8 produced by F625-substituted CharTPS7 may have resulted from direct deprotonations of cation C, or from verticillene-4-yl+ and verticillene-8-yl+-mediated cyclizations (blue, green and pink arrows). The carbon numbering system of 3 (in brown) differs from 4−8 (in black). (D) Summary of the product mixtures of different CharTPS7 mutants.
本研究通过柱冠粗榧转录组的挖掘，发现了三尖杉烷型二萜生物合成相关的关键萜类环化酶并对其生物学功能进行了验证，阐明了三尖杉属植物中单功能I型DiTPS所驱动的碳正离子级联反应，是三尖杉烷型二萜类化合物生物合成途径解析的一个重要突破，深化了对于裸子植物二萜代谢多样性的遗传基础的理解，为进一步利用合成生物学开发和创新具有较高药用价值的三尖杉烷二萜奠定了基础。
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
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