The Plant Cell | 中国科学院植物研究所秦国政课题组揭示转录因子FvRIF调控草莓果实成熟的分子机制

草莓果实含有丰富的营养物质且具有特色香气，在世界范围内广泛种植，素有“水果皇后”的美称，具有重要的经济价值。成熟是草莓果实发育的重要阶段，也是果实营养物质和风味品质形成的关键时期。解析果实成熟的调控机制对于提升草莓果实品质、培育优良新品种具有重要指导意义。草莓果实成熟过程受多因素影响，其中转录因子发挥着重要调控作用。早期研究中，西班牙研究人员通过基因沉默技术（RNAi），证实NAC转录因子FaRIF（Ripening Inducing Factor）对于八倍体栽培草莓的成熟至关重要，但其具体作用机制及其调控网络尚不清楚。

近日，中国科学院植物研究所秦国政课题组在The Plant Cell上在线发表了题为“Deciphering the regulatory network of the NAC transcription factor FvRIF, a key regulator of strawberry fruit ripening”的研究论文，揭示了FvRIF在二倍体野生草莓果实成熟调控中的功能，并在全基因组水平鉴定了FvRIF的靶基因，阐明了蛋白质磷酸化修饰对于FvRIF活性的调节作用。

在该研究中，研究人员首先利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在二倍体草莓中获得了FvRIF基因敲除突变体，发现Fvrif突变株的果实表现出成熟抑制表型，甚至在果实衰老后期也不能正常转色。在突变株的果实中，花青苷积累、果实软化、糖代谢等受到显著抑制。相反，超表达FvRIF则显著促进草莓果实成熟。

为了揭示FvRIF调控草莓果实成熟的分子机制，研究人员利用DAP-seq结合RNA-seq技术对FvRIF调控的下游靶基因进行了全基因组鉴定，获得了2080个可能受FvRIF直接调控的基因，涉及多个代谢途径。进一步通过ChIP-qPCR、EMSA、酵母单杂交、RT-qPCR等技术证实FvRIF直接调控花青苷合成、细胞壁代谢途径中的多个关键基因，说明FvRIF通过直接调控这些基因的方式影响草莓果实色素合成及果实软化。此外，研究发现FvRIF可结合137个转录因子基因并调控它们的表达，包括多个已知与草莓果实发育和成熟相关的转录因子，表明FvRIF可能位于草莓果实成熟调控的上游，通过调控重要转录因子的方式间接调节果实成熟。

转录因子活性受到蛋白质翻译后修饰的影响，包括磷酸化、泛素化、乙酰化等。其中，磷酸化修饰对转录因子活性的影响最为普遍。通过磷酸化位点预测，研究人员发现FvRIF蛋白中存在一个磷酸化位点Thr-310，其对应的激酶为MAPKs。酵母双杂交分析显示，草莓的12个MAPKs中，仅FvMAPK6与FvRIF发生相互作用。免疫共沉淀等生化研究及细胞共定位分析证实了FvMAPK6与FvRIF的生理互作。研究人员进一步通过Phos-tag体外磷酸化分析，发现FvMAPK6能够磷酸化FvRIF，且该磷酸化过程依赖于FvMKK4。利用LC-MS/MS质谱分析，鉴定到FvRIF上的5个磷酸化位点，分别为Tyr-271、Ser-283、Ser-294、Ser-299和 Thr-310。位点突变分析显示，仅Thr-310是关键的磷酸化位点，该位点突变后，FvRIF几乎完全失去了FvMAPK6诱导的磷酸化修饰。GUS转录活性分析显示，FvMAPK6介导的FvRIF磷酸化可显著提高其转录活性，说明磷酸化修饰正调控FvRIF活性。

为了分析磷酸化修饰是否在体内调控FvRIF活性，研究人员在Fvrif突变体背景下分别表达了完整形态FvRIF蛋白以及关键磷酸化位点Thr-310发生突变的FvRIF蛋白。完整形态FvRIF蛋白能够回复Fvrif突变体的成熟缺陷表型，而Thr-310点突变的FvRIF蛋白则没有这种能力，说明磷酸化修饰在FvRIF活性调控中发挥重要作用。

综上所述，该研究不仅揭示了FvRIF调控草莓果实成熟的分子机制，在全基因组水平鉴定了FvRIF的靶基因，而且明确了蛋白质磷酸化修饰对于FvRIF活性的重要性，为利用分子设计育种提高果实品质、延长果实货架期提供了目标基因。

中国科学院植物研究所秦国政研究员和西班牙马拉加大学David Posé为本文通讯作者，博士研究生李晓静为第一作者。北京农学院沈元月教授和中国农业大学李冰冰教授参与了论文的指导和研究工作。该研究得到了国家自然科学基金等项目的资助。

论文链接：

https://doi.org/10.1093/plcell/koad210

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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