NBE | 武汉大学张楹/殷昊揭示渗透压调节cGAS-STING通路在非病毒递送CRISPR构建CAR-T中的新机制

病毒传递DNA对人类T细胞进行靶向重编程可能导致随机基因组整合，电穿孔效率低且可能有毒。

2023年7月27日，武汉大学张楹及殷昊共同通讯在Nature Biomedical Engineering（IF=28）在线发表题为“Enhancement of the viability of T cells  electroporated with DNA via osmotic dampening of the DNA-sensing cGAS-STING pathway”的研究论文，该研究表明，电穿孔诱导的原代人T细胞毒性是由胞质途径cGAS-STING(环鸟苷单磷酸-腺苷单磷酸(cGAMP)合成酶刺激干扰素基因)介导的。

该研究还表明，通过筛选电穿孔条件鉴定的等渗缓冲液可以减少cGAS-STING监视，从而产生嵌合抗原受体(CAR-T)细胞，其CAR-T细胞数量比标准电穿孔高20倍，体内抗肿瘤活性比慢病毒生成的CAR-T细胞高。电穿孔缓冲液的渗透压抑制了cGAS-DNA的相互作用，影响了STING激活剂2 ' 3 ' -cGAMP的产生。该缓冲液在转染治疗相关的原代T细胞和人造血干细胞方面也具有卓越的效率。该发现可能有助于优化电穿孔介导的DNA递送，以生产基因组工程T细胞。

嵌合抗原受体(CAR) T细胞和转基因T细胞受体(TCR) T细胞等人类T细胞的重编程为癌症治疗带来了希望。对于市场上和临床试验中使用的大多数CAR- T细胞产品，慢病毒载体用于递送CAR和TCR转基因3。然而，对于以慢病毒为基础的治疗，随机基因组整合引起了对其致癌潜力和可变转基因表达的安全性和有效性的担忧。最近的研究应用通过腺相关病毒（AAV）递送的基因组编辑核酸酶和供体DNA模板将CAR插入TCRα常数（TRAC）位点，这导致了持续的CAR表达，并比慢病毒载体产生的CAR-T细胞更有效的肿瘤杀伤作用。然而，尽管AAV介导的供体递送可能更有效，但生产GMP级AAV是复杂、缓慢和昂贵的，并且病毒骨干整合到基因组的可能性仍然是一个安全问题。

与AAV递送相比，非病毒递送DNA供体是一种更快、更经济的替代方法，因为DNA供体材料可以通过PCR或线性化质粒轻松获得。然而，几十年来人们已经知道原代T细胞不能很好地耐受DNA转染;事实上，质粒DNA的电穿孔可诱导大量T细胞死亡。最近的一项研究表明，在原代T细胞中使用PCR产物作为供体模板，并在与Cas9/单导RNA (gRNA)核糖核蛋白(RNP)复合物共转染时提高了细胞活力。然而，即使使用优化的转染方案，也只能产生少量的CAR - T细胞，并使用荧光活化细胞分选(FACS)来富集下游应用的活细胞。并且，DNA转染会对原代T细胞造成严重损伤，但其潜在机制尚不清楚。

环GMP-AMP合成酶(cGAS)是细胞质中双链DNA (dsDNA)的关键传感器，其激活导致蛋白STING(干扰素基因刺激因子)启动干扰素依赖性免疫反应。在细胞质中识别dsDNA后，cGAS生成2 ' 3 '-cGAMP。后者结合并激活STING，导致其从内质网(ER)转移到高尔基体。此时，STING棕榈酰化并招募TANK结合激酶1 (TBK1)。TBK1磷酸化STING的Ser366位点，为干扰素调节因子3 (IRF3)提供对接位点，IRF3随后被TBK1磷酸化并激活。磷酸化的IRF3易位进入细胞核并激活下游的干扰素基因。已有研究表明，T细胞中的STING激活会导致细胞死亡。

等渗缓冲介导的cGAS-STING活化衰减模型（图源自Nature Biomedical Engineering ）

该研究发现cGAS - STING的激活是DNA转染后T细胞死亡的原因，通过敲除人或小鼠T细胞中的cGAS或STING，可以阻止DNA诱导的细胞死亡，并且通过恢复小鼠Sing - / - T细胞中的STING表达，可以在DNA刺激下触发细胞凋亡。为了减轻cGAS监测，作者筛选了数百种电穿孔缓冲液和电穿孔设置的组合，并确定了一种组合，该组合导致cGAS - STING激活最小，并且与商业电穿孔标准相比，将CAR- T细胞的存活率提高了20倍。

在机制上，电穿孔缓冲液的渗透压在介导cGAS与DNA的结合中起重要作用，从而调节2 ' 3 ' -cGAMP的产生和STING的激活。此外，通过DNA电穿孔产生的CAR - T细胞显示出更强的肿瘤杀伤活性，并且电穿孔导致产生的CAR - T细胞数量比慢病毒递送更多。电穿孔缓冲液在其他细胞类型(包括治疗相关的人类造血干细胞)中的转染效果也很好。总的来说，该研究揭示了DNA转染诱导T细胞死亡的原因，并确定了提高工程T细胞的细胞活力和效力的途径。

武汉大学医学研究院研究生安静、云南大学生命科学学院研究生张川平、武汉大学医学研究院研究生邱厚圆和博士后张红霞为共同第一作者。武汉大学医学研究院张楹教授和殷昊教授为共同通讯作者。殷昊教授是泰康生命医学中心双聘PI。武汉大学医学研究院仪器设备共享中心为论文提供了硬件平台，及武汉大学舒红兵实验室提供了STING敲除小鼠。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41551-023-01073-7

转自：“iNature”微信公众号

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