导读
环境污染物双酚A（BPA）用于制造各种饮食的塑料包装材料，广泛分布在环境中，并通过诱导氧化应激导致严重的肝毒性。艾叶精油（AAEO）是从艾叶中分离出来的一种挥发油成分，具有药理作用，尤其具有保肝作用。然而，AAEO在BPA诱导的肝毒性中的潜在作用尚未得到表征。我们首先用气相色谱-质谱法分析了AAEO中的化学成分，随后研究了AAEO对暴露于BPA的小鼠肝脏代谢变化的影响。结果表明，与BPA组相比，AAEO可以降低BPA小鼠血清中肝功能酶的水平，改善肝脏病变和纤维化。此外，代谢组学筛选的20种差异代谢产物主要参与谷胱甘肽代谢、嘌呤代谢和多不饱和脂肪酸合成的重编程。此外，AAEO可以减少BPA诱导的肝铁死亡，如降低黄嘌呤氧化酶活性，上调谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性，以及SLC7A11的表达，以促进谷胱甘肽的合成，同时抑制转铁蛋白受体1（TFR1）的表达以减少细胞中Fe2+的积累。因此，AAEO是一种肝脏保护剂，可通过逆转铁死亡的发生从而拮抗BPA诱导的肝毒性。
论文ID
原名：Hepatoprotective effect of Artemisia Argyi essential oil on bisphenol A-induced hepatotoxicity via inhibition of ferroptosis in mice
译名：艾叶精油通过抑制铁死亡对双酚A诱导的小鼠肝毒性的保护作用
期刊：Environmental Toxicology
IF：4.5
发表时间：2023.06
通讯作者：徐霞&汤有才&魏博&廖兴林
通讯作者单位：郑州大学
实验设计
实验结果
1. 基于GC–MS的艾精油化学成分研究
我们以0.40%（w/w）的产率获得了艾叶干燥地上部分的蒸馏精油，其为具有特征气味的淡蓝色液体。我们通过使用Thermo SCIENTIFIC TG-5SILMS柱进行GC–MS/MS分析，从AAEO中共鉴定出59种化合物（图S1）。详细的化学成分如表S1所示。主要成分为L-樟脑、β-石竹烯、香芹酮、1,8-桉叶素和α-松油醇。先前的研究中也报道了1,8-桉叶素、L-樟脑和β-石竹烯，但与本研究相比，这些成分的百分比不同。化学成分的变化可能与地理位置、遗传因素、采集时间和其他因素的影响有关。
图1 艾叶精油对双酚A所致小鼠肝毒性的保护作用
（A）每个实验组小鼠的体重趋势。在小鼠血清中检测肝脏参数，包括（B）丙氨酸转氨酶（ALT）、（C）天冬氨酸转氨酶（AST）和（D）碱性磷酸酶（ALP）。（E，F）各实验组苏木精和伊红染色肝组织的组织病理学检查和炎性细胞数统计（H&E，Bar=50μm，×200）。切片中的细胞坏死、炎症细胞浸润和细胞空泡化用黑色箭头标记。（G，H）Masson染色用于检测各组小鼠肝组织中的纤维化（Masson，Bar=100μm，×100）。（I，J）TUNEL染色检测各组小鼠肝脏细胞凋亡（Bar=50μm，×200）。绿色荧光表示阳性凋亡细胞，蓝色表示细胞核。数据以平均值±标准差表示（n=12，A–D；n=6，E–J）。*P<.05，**P<.01，***P<.001。
2. AAEO对BPA肝毒性的保护作用
实验过程中，各组小鼠的体重呈逐渐增加的趋势，状态良好（图1A）。与对照组相比，BPA组小鼠血清样本中的ALT、ALP和AST水平分别显著升高了21.45%、23.25%和24.20%（图1B-D）。与BPA组相比，低浓度AAEO给药(BPA+AL)组的ALT、ALP和AST水平分别显著下降19.88%、16.50%和18.25%；此外，高浓度AAEO给药(BPA+AH)组进一步降低了它们，分别降低了21.71%、21.16%和27.47%。这些结果表明，AAEO对BPA诱导的肝毒性具有很强的保护作用。
我们通过H&E染色检查小鼠肝组织的病理程度（图1E）。BPA组观察到明显的细胞核缩小、肝细胞更多的脂肪变性和大量炎症细胞浸润。而与BPA组相比，BPA+AL组可逆转肝毒性。BPA+AH组可进一步改善肝损伤，使其恢复接近对照组（图1F）。
此外，TUNEL染色用于检测各组小鼠肝细胞的凋亡。如图1I所示，我们在对照组中几乎没有观察到凋亡细胞，BPA组肝细胞凋亡率增加到对照组的1.8倍。此外，BPA+AL组和BPA+AH组的肝细胞凋亡率分别比BPA组低8.12%和12.35%（图1J）。
图2 艾叶精油对双酚A暴露小鼠肝组织代谢特性的影响
（A）对照组（红色圆圈）、BPA组（黑色圆圈）、BPA+AL组（白色圆圈）、BPA+AH组（粉色圆圈）和BPA+甘草酸二铵(DG)组（蓝色方块）之间的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）分别在ESI+和ESI-模式下显示出良好的分离趋势。（B）在OPLS-DA载荷图中，每组样品中的所有化合物分别在ESI+和ESI-模式下显著不同。（C）置换图分析。结果表明，该模型建立成功，不存在过拟合现象。
3. AAEO对BPA暴露后小鼠肝组织代谢特性影响的UPLC-MS/MS分析
为了研究AAEO对BPA诱导肝毒性的保肝作用分子机制，我们分别在ESI+和ESI-模式下通过UPLC-MS/MS代谢组学技术评估了各组小鼠肝组织的代谢组学特征。ESI+和ESI-模式下小鼠肝组织QC样品的总离子色谱图（TICs）如图S2所示。为了评估各组之间代谢物的差异，OPLS-DA评分图结果显示，样本显示出组内聚集和组间分离的良好趋势（图2A）。样品中检测到的代谢物分散在OPLS-DA载荷图中，在正离子和负离子模式下的代谢物显著不同（图2B）。同时，置换图表明，本研究构建的模型是成功的，没有过拟合现象（图2C）。
图3 艾叶精油对双酚A暴露后小鼠肝组织代谢途径的影响
（A）对照组、BPA组和BPA+AH组中20种小分子差异代谢产物（VIP>1和P<.05）的热图分析。红色和蓝色分别表示化合物含量的上调和下调。（B）组间差异代谢产物富集分析图。（C）不同代谢途径的气泡图。（D）内源性差异化合物的直方图。所有数值均显示为平均值±标准差（n=6）。*P<.05，**P<.01，***P<.001。
4. AAEO对BPA暴露后肝组织差异代谢产物的影响
我们通过质谱分析以及与HMDB和mzCloud公共数据库进行比对重新确认了差异代谢物的结构，在所有数据标准化后，对照组、BPA组和BPA+AH组之间的差异代谢物的趋势如热图所示（图3A）。所获得的20种差异代谢物的含量在对照组和BPA组之间发生了显著变化，而BPA+AH组可以显著逆转BPA诱导的变化（表S2），包括次黄嘌呤、黄嘌呤、肌酸酐、腺苷、腺嘌呤、鸟嘌呤、花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、谷胱甘肽（GSH）、5-氧脯氨酸、谷氨酸、GSSG、半胱氨酸、γ-谷氨酰缬氨酸、γ-谷氨酰亮氨酸、γ-谷氨酰苯丙氨酸、γ-谷氨酰精氨酸和γ-谷氨酰丙氨酸（图S3）。
图4 艾叶精油对双酚A肝毒性小鼠的肝组织具有较强的抗氧化作用
（A）检测各组小鼠的尿酸水平和（B）XOD活性。（C）SOD表达和（D）CAT表达。（E，F）DHE染色以检测小鼠肝组织中活性氧的水平（Bar=50μm，×200）。数据以平均值±标准差表示（n=6）。**P＜0.01，***P＜0.001。
5. AAEO对BPA暴露后肝组织代谢途径的影响
与对照组相比，BPA小鼠肝组织中肌苷、鸟苷、腺嘌呤、鸟嘌呤、花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、氧化型谷胱甘肽、5-氧脯氨酸、γ-谷氨酰缬氨酸、γ-谷氨酰亮氨酸、γ-谷氨酰苯丙氨酸、γ-谷氨酰精氨酸和γ-谷氨酰丙氨酸水平显著升高（图3D）。然而，与BPA组相比，BPA+AH组减少了这些代谢产物。同时，与对照组相比，BPA组的谷氨酸、半胱氨酸、次黄嘌呤、谷胱甘肽和黄嘌呤含量显著下降。而这些化合物的水平在BPA+AH组中显著逆转。为了进一步研究AAEO调节的代谢途径，我们将差异代谢物导入MetaboAnalyst网站（图3B，C）。通路分析和富集分析相结合表明，AAEO对BPA诱导的肝毒性发挥保护作用，主要通过调节谷胱甘肽代谢、嘌呤代谢和多不饱和脂肪酸生物合成（表S3和S4）。
6. AAEO逆转BPA诱导的血清尿酸水平升高
我们通过尿酸含量检测试剂盒检测各组血清样品中嘌呤代谢的最终产物尿酸的含量（图4A）。与对照组相比，BPA组血清尿酸含量显著升高31.52%。然而，与BPA组相比，给予AAEO使BPA+AL组的血清尿酸水平降低了10.09%，而BPA+AH组的血尿酸水平进一步降低了27.48%。
7. AAEO减少BPA诱导的肝组织黄嘌呤氧化酶（XOD）活性异常上调
嘌呤代谢关键酶XOD活性检测结果显示，与对照组相比，BPA组XOD活性显著提高39.67%。然而，与BPA组相比，BPA+AL组和BPA+AH组的XOD活性分别降低了16.72%和31.76%（图4B）。这一结果表明，AAEO可以逆转BPA诱导肝毒性引起的肝组织XOD活性的增加。与之前的血清尿酸水平检测结果一致，AAEO可以通过抑制BPA诱导的XOD活性上调来下调血清尿酸水平。
图5 艾叶精油对双酚A诱导肝毒性的护肝作用与铁死亡之间的相关性
（A）各组小鼠肝组织中TFR1表达、（B）Fe2+水平、（C）SLC7A11表达、（E，F）GPX4表达和活性、（F）丙二醛（MDA）含量。各组小鼠肝组织中（G）IL-6（H）IL-1β和（I）TNF-α的表达。所有数值均显示为平均值±标准差（n=6）。**P＜0.01，***P＜0.001。
8. AAEO逆转BPA诱导的肝组织氧化应激
DHE染色结果显示，与对照组相比，BPA显著提高了小鼠肝脏中49.51%的ROS水平。然而，与BPA组相比，BPA+AL组和BPA+AH组肝组织中的ROS水平分别降低了27.94%和47.92%（图4E，F）。为了进一步研究AAEO对BPA诱导的肝组织氧化应激的保护作用，我们采用实时定量PCR实验检测各组肝组织中超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）等氧化应激相关指标的mRNA表达。结果如图4C、D所示，BPA组SOD和CAT的mRNA表达与对照组相比分别显著降低了51.58%和38.54%。此外，AAEO以剂量依赖的方式显著增加肝组织中SOD和CAT的mRNA表达，使其分别接近正常水平。这些结果表明，AAEO可以通过逆转BPA诱导的肝组织氧化应激而发挥保肝作用。
9. AAEO逆转BPA诱导的铁死亡标志物紊乱
我们检测肝脏中的铁死亡相关标志物，以验证AAEO对BPA诱导肝毒性的肝保护作用与铁死亡之间的关系。转铁蛋白受体1（TFR1）表达的上调被认为是铁死亡的关键标志之一。与对照组相比，BPA组肝组织中TFR1和Fe2+含量的mRNA表达水平分别显著提高了80.22%和66.53%。然而，与BPA组相比，BPA+AL组可使TFR1和Fe2+的mRNA表达水平分别降低23.61%和32.05%，而BPA+AH组可进一步使其分别降低61.89%和68.10%，接近对照水平（图5A，B）。实验结果表明，AAEO可以通过逆转BPA暴露后TFR1的上调和降低细胞内铁含量来发挥肝脏保护作用。
为了进一步探索AAEO抑制铁死亡的机制，我们测定了胱氨酸转运系统Xc—的主要催化亚基SLC7A11和铁死亡关键酶GPX4的mRNA表达。与对照组相比，BPA组肝组织中SLC7A11的mRNA表达水平显著降低了39.54%（图5C）。此外，与对照组相比，BPA组肝组织中GPX4的mRNA表达和活性分别显著降低了41.58%和27.81%。AAEO处理后，与BPA组相比，BPA+AL组GPX4的mRNA表达和活性分别显著增加了17.29%和14.82%，而BPA+AH组分别显著增加了40.51%和26.96%（图5D，E）。结果表明，AAEO可逆转BPA作用后SLC7A11的下调，促进胱氨酸的摄取，提高GPX4的活性，抑制铁死亡。
与对照组相比，BPA组的MDA含量显著增加了86.72%。AAEO处理后，BPA+AL组和BPA+AH组的MDA含量分别显著低于BPA组的62.69%和77.75%（图5F）。这表明AAEO可以通过抑制铁死亡显著减少BPA诱导的脂质过氧化物积累。
图6 艾叶精油（AAEO）通过抑制铁死亡对双酚A（BPA）诱导的小鼠肝毒性具有保肝作用
红色的向上或向下箭头分别表示与对照小鼠相比，BPA处理诱导的差异代谢产物显著增加或减少。绿色的向上或向下箭头表示与BPA小鼠相比，AAEO治疗调节的差异代谢产物显著增加或减少。
10. AAEO逆转BPA诱导的肝脏炎症反应
大量研究表明，增加GPX4活性和降低MDA含量可以抑制炎症反应。实验结果显示，与对照组相比，BPA组肝组织中的炎症细胞因子如IL-6、IL-1β和TNF-α分别显著增加94.44%、72.86%和87.08%。与BPA组相比，BPA+AL组肝组织中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平分别降低了49.64%、17.51%和22.66%。同时，BPA+AH组将这三种炎症细胞因子的水平分别降低了79.64%、57.51%和62.70%（图5G–I）。
讨论
本研究通过综合策略及其机制，研究了艾叶精油的主要化学成分及其对BPA诱导的小鼠肝毒性的保肝作用。结果表明，700.00 mg/kg的BPA灌胃可诱导小鼠肝毒性，而AAEO给药可显著减轻小鼠的肝毒性，这可通过改善血清中的肝功能酶和组织病理学改变来证明。此外，基于UPLC-MS/MS的非靶向代谢组学技术用于分析AAEO处理后小鼠肝组织中小分子代谢产物的变化。分子生物学技术进一步验证了主要差异代谢途径中的关键酶。我们的研究表明，AAEO主要通过抑制铁死亡来逆转BPA诱导的肝毒性（图6）。
BPA是一种环境污染物，在日常生活中广泛使用和分布，很难完全避免。它主要由肝脏代谢，容易引起肝脏过度氧化应激和炎症，导致肝细胞凋亡。我们的数据显示，BPA组的血清肝功能标志物AST、ALT和ALP水平显著高于对照组，表明BPA诱导的肝损伤模型已成功建立。同时，小鼠肝组织的H&E和Masson染色显示组织病理学改变和胶原沉积表明，BPA可显著诱导小鼠炎症细胞浸润、肝细胞坏死和肝纤维化，这些结果与我们之前的发现一致。TUNEL染色结果支持BPA引起肝细胞凋亡。AAEO的成分通过Q Exactive GC Orbitrap GC–MS/MS鉴定。目前的研究已经证实，AAEO的许多成分具有很强的保肝作用。例如，L-樟脑，一种天然萜类化合物，可以通过上调肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶的活性和GSH的含量来增强肝组织的抗氧化作用。β-石竹烯减少了促炎介质，如TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB链增强剂，从而改善了以炎症和氧化应激为特征的肝病。香芹酮可能通过与脂肪酸竞争结合白蛋白而发挥保肝作用，从而减少肝细胞中的脂质积聚和氧化应激。1,8-桉叶素可以通过失活Akt/PI3激酶途径来治疗小鼠肝脏的脂肪变性和纤维化。此外，α-松油醇可以以剂量依赖的方式降低肝组织中丙二醛的含量，降低肝脏的氧化应激和组织病理学。在本研究中，正如预期的那样，AAEO逆转了血清中AST、ALT和ALP水平的异常升高，改善了组织病理学变化，减少了胶原沉积，最终降低了BPA暴露小鼠肝组织中的肝细胞凋亡。因此，AAEO的主要保肝成分可能包括β-石竹烯、香芹酮、L-樟脑、1,8-桉叶素和α-松油醇。
为了揭示AAEO对BPA诱导肝毒性的保肝作用的潜在机制，我们使用基于UPLC-MS/MS的代谢组学技术系统地表征了内源性小分子代谢物的数据库。通过在线数据库MetaboAnalyst进行分析，筛选出的20种显著差异的小分子代谢物主要富集在嘌呤代谢、谷胱甘肽代谢和多不饱和脂肪酸生物合成等代谢途径上。
谷胱甘肽生物合成的抑制显著降低了强抗氧化剂GSH和GPX4的水平，多不饱和脂肪酸生物合成途径的异常上调显著加剧了细胞氧化应激，从而进一步促进了铁死亡的发生。肝脏具有内源性抗氧化剂或抗氧化应激酶，包括谷胱甘肽和GPX4。因此，减少脂质过氧化物的积累和抑制肝脏中促炎因子的释放将发挥保肝作用。此外，胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白（系统Xc—）介导细胞摄取胱氨酸，胱氨酸对GSH合成至关重要，也是预防铁死亡的主要途径之一。SLC7A11是Xc—系统的主要功能亚基。总之，GSH、SLC7A11水平的降低和GPX4活性的降低最终促进铁死亡。本研究发现，与对照组相比，BPA组肝组织中SLC7A11的mRNA表达、GPX4的活性、GSH的含量和GSH/GSSG的水平显著降低，这表明BPA损伤后肝组织铁死亡增强。同时，BPA小鼠多不饱和脂肪酸生物合成途径中的亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸等PUFA含量显著增加。然而，BPA+AH组可以上调γ-谷氨酰循环，如通过激活SLC7A11 mRNA表达增加GPX4活性、GSH含量和GSH/GSSG水平，还可以显著减少BPA组中多不饱和脂肪酸的积累。因此，AAEO的保肝作用主要是通过调节BPA暴露后谷胱甘肽和PUFA的生物发生，这表明AAEO在抑制铁死亡方面具有潜在作用。
此外，铁死亡的标志物转铁蛋白受体1（TFR1）的过度表达可能导致细胞内铁离子的积累。与对照组相比，BPA小鼠肝组织中TFR1的表达和Fe2+的含量增加，表明BPA显著增加了进入小鼠肝组织的铁离子水平。然而，AAEO可以显著降低TFR1的表达和Fe2+的含量，使其接近正常。这些数据表明，AAEO确实可以通过上调TFR1来减少Fe2+的流入和积累，从而抑制肝脏铁死亡。
此外，代谢组学结果还发现，与我们之前的研究一样，BPA诱导的肝毒性伴随着嘌呤代谢紊乱。我们的研究发现，BPA组中鸟苷、鸟嘌呤、腺嘌呤和肌苷等代谢产物的含量显著增加，表明暴露于BPA后嘌呤代谢被激活。同时，我们的研究发现，由于XOD的活性显著增强，次黄嘌呤和黄嘌呤向尿酸的转化得到了促进。结果表明，AAEO处理可以通过抑制XOD的活性来逆转嘌呤代谢紊乱，减少UA的产生。此外，XOD在催化次黄嘌呤和黄嘌呤产生尿酸的过程中产生大量ROS，导致严重的氧化应激诱导的肝毒性。有证据表明，炎症与XOD和PUFA的紊乱密切相关。AAEO可以通过降低XOD的活性来逆转嘌呤代谢紊乱，并通过增加小鼠肝组织中SOD和CAT的mRNA表达来显著降低肝组织的氧化应激和炎症反应。
结论
总之，本研究采用GC–MS/MS对AAEO的化学成分进行了分析，然后基于UPLC-MS/MS代谢组学技术结合分子生物学技术，研究了AAEO对BPA诱导的小鼠肝毒性的保肝机制。我们的研究首次证明，AAEO可以通过激活系统Xc—来逆转BPA诱导的γ-谷氨酰循环和非饱和脂肪酸生物合成的紊乱，并通过减少TFR1 mRNA的表达来减少肝组织中Fe2+的积累，从而抑制BPA暴露诱导的小鼠肝组织铁死亡。此外，AAEO可通过降低XOD活性来抑制BPA引起的嘌呤代谢异常激活，并通过增加小鼠肝组织中SOD和CAT的mRNA表达来显著降低肝组织中的氧化应激和炎症反应（图6）。这些发现证实了抑制肝铁死亡在BPA诱导肝毒性治疗策略中的关键作用，并揭示AAEO将在BPA诱导肝毒性中发挥保护作用。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37347548/
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