类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是临床上常见的一种炎症性疾病，症状主要表现为持续性疼痛、压痛和关节破坏[1]。祖国医学认为RA属于“痹证”范畴，主要因气血痹阻，经脉不通而痛；气行不畅而痹阻经络；血瘀气阻而化热[2]。目前我国RA患病率约0.42%，全球患病率约0.27%[3-4]。RA作为慢性疾病已成为全世界关注的公共卫生问题之一。RA的标准治疗手段主要用于控制炎症和关节疼痛，但常用的非甾体抗炎药、糖皮质激素、改善病情的抗风湿药物和生物制剂长期服用会引起不良反应[4-5]。因此，寻找安全、有效的治疗药物或治疗策略对RA临床治疗具有重要意义。RA的病理过程受T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞等免疫细胞与成纤维样滑膜细胞之间的串扰影响[6]。免疫细胞的激活会分泌多种炎症因子，进而影响软骨细胞、破骨细胞和成纤维细胞导致软骨损伤和骨骼破坏[5-6]。干预这些免疫细胞或免疫因子作为RA治疗相关研究的新方法和新靶点具有很大的潜力，相关的治疗方案仍在研究中[6]。
细胞死亡与RA的疾病发展密切相关。如成纤维样滑膜细胞死亡减少导致滑膜细胞过度增殖，从而引发滑膜炎[7]。自身免疫性T细胞和B细胞的细胞死亡失衡也会增加自身免疫反应和炎症反应[8]。随着细胞死亡研究领域的快速发展，针对RA细胞死亡的相关临床治疗策略也取得了一定的进展[7-8]。铜死亡是一种新发现的细胞死亡方式，其机制与线粒体呼吸相关[7]。铜离子通过与三羧酸循环过程中的脂酰化蛋白质结合，使脂酰化蛋白聚集导致铁硫簇蛋白丢失，进而诱发蛋白质毒性应激并造成细胞死亡[7,9]。相关研究结果显示RA患者血液中铜含量升高，且与炎症标志物呈正相关[10]。铜死亡相关基因丙酮酸脱氢酶E1 α1亚基（pyruvate dehydrogenase E1 subunit alpha 1，PDHA1）可能与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）协同调节RA中的巨噬细胞炎症反应，且铜死亡另一相关基因丙酮酸脱氢酶E1亚基β（pyruvate dehydrogenase E1 subunit beta，PDHB）可能与成纤维样滑膜细胞的异常增殖相关[11]。由此可见，阐明铜死亡在RA发病过程中的作用机制并探寻相关治疗药物具有重要的研究意义。
传统中医药是中华文化的瑰宝，治疗RA已有近千年历史。临床上中医主要通过祛风除湿、散瘀活血、通络止痛来消除痹症，代表性的复方有蠲痹汤、独活寄生汤、乌头汤和桂枝芍药知母汤[2,12]。有实验表明传统中药及其有效成分可以通过促进细胞凋亡、抑制成纤维样滑膜细胞异常增殖和抗炎等作用缓解RA症状[2,13]。然而中药及其活性成分能否通过靶向铜死亡治疗RA尚未见相关研究报道。本研究旨在通过生物信息学方法阐明铜死亡相关基因在RA中的表达及作用机制，筛选靶向铜死亡相关基因的中药及其活性成分。为明确铜死亡在RA中的调控机制并开发用于防治RA的靶向调节药物提供理论基础。
1 方法
1.1 铜死亡相关基因集获取
以“cuproptosis”和“铜死亡”为关键词分别检索PubMed数据库（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）和中国知网数据库（https://www.cnki.net/）截至2022年9月30日收录的与铜死亡相关文献，构建铜死亡相关基因集。共获得10个与铜死亡密切相关的基因：细胞周期依赖性激酶抑制基因（cell cycle-dependent kinase inhibitory gene，CDKN2A）、铁氧还原蛋白1（ferridoxin 1，FDX1）、二氢硫辛酰胺脱氢酶（dihydrolipoamide dehydrogenase，DLD）、二氢硫辛酸转乙酰化酶（dihydrolipoamide acetyltransferase，DLAT）、硫辛酸合成酶（lipoic acid synthetase，LIAS）、谷氨酰胺酶（glutaminase，GLS）、脂酰转移酶1（lipoyltransferase 1，LIPT1）、金属调节转录因子1（metal regulatory transcription factor 1，MTF1）用于后续分析[9]。
1.2 RA滑膜基因表达数据集获取
以“rheumatoid arthritis”为关键词检索由美国国立生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）创建并维护的基因表达数据库（Gene Expression Omnibus，GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），获取RA基因表达数据集。数据集筛选要求：（1）数据集包含RA组和正常对照组，且每组样本量不少于3；（2）RA组未经药物或其他手段干预治疗；（3）数据集信息完整无缺失。
1.3 RA样本分型
基于铜死亡相关基因在GEO数据集RA样本中的表达水平，使用Consensus Cluster Plus R语言包对所有RA样本进行表达一致性聚类分析，将样本分为铜死亡基因表达模式不同的亚型。
1.4 基因表达差异分析
通过RStudio 2022.02.1软件的“Limma”R语言包，对检索得到的基因表达数据集根据不同分组进行基因表达差异分析。以差异倍数（fold change，FC）绝对值大于2及矫正后P＜0.05为差异表达基因（differentially expressed gene，DEG）筛选标准。差异分析结果通过微生信（https://www. bioinformatics.com.cn/）在线网页工具对结果进行可视化处理。
1.5 免疫浸润分析
基于基因表达数据矩阵使用CIBERSORT去卷积法评估每个样本中22种免疫细胞占比。比较不同分组间（正常对照组vs RA组、RA1组vsRA2组）22种免疫细胞丰度差异。
1.6 富集分析
将需要分析的基因简称导入在线网页工具Kobas（http://bioinfo.org/kobas）进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。分析物种设置为“智人（homo sapiens）”，以P＜0.05为筛选标准。
1.7 潜在治疗中药预测
对在RA病理过程中发挥重要作用的铜死亡相关基因，通过本草图鉴数据库（HERB，http://herb.ac.cn/）检索其相应中药。针对涵盖靶点较多的中药，通过检索相关文献，确定其有效成分。通过SwissADME在线工具（http://www.swissadme. ch）依据里宾斯基五规则（Lipinski’s rule of five，RO5）筛选出成药性较好的有效成分，并使用ProTox-II在线工具对有效成分进行安全性评估[14]。借助AutoDockTools 1.5.6软件模拟中药有效成分结合铜死亡相关基因，预测其治疗RA的潜在可能。
1.8 临床样本收集
本研究获得甘肃省中医院伦理委员会批准（批准文号2020-031-01），所有研究对象均签署知情同意书。本研究于甘肃省中医院共收集5例健康志愿者外周血样本（健康对照组）及5例临床诊断为RA患者（RA组）外周血样本，所有外周血样本通过提取试剂分离出单核细胞，放入−80 ℃冰箱保存。
纳入标准：（1）RA组患者经临床医生诊断符合2010年美国风湿病学会联合欧洲抗风湿病联盟提出的RA诊断标准；（2）RA组患者处于RA疾病活动期；（3）年龄18～80岁；（4）性别不限；（5）签署知情同意书者。排除标准：（1）患有精神疾病或其他原因无法配合者；（2）合并其他急慢性疾病者；（3）近期有生育要求或正处于妊娠期或哺乳期的女性；（4）入组前4周内使用过药物干预治疗者。
1.9 实时荧光定量-PCR（real-time fluorescence quantification-PCR，RT-qPCR）分析
通过Trizol法提取外周血样本单个核细胞总RNA，检测浓度后取1000 ng RNA为模板逆转录为cDNA（Takara，RR047A）。引物序列如表1所示，使用SYBR green染料（诺唯赞，批号Q141-02）按20 μL体系进行40个循环的扩增。Ct值以磷酸甘油醛脱氢酶（reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参按2−∆∆Ct法分析。
1.10 统计分析
研究数据采用SPSS 16.0软件分析，结果以表示，两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 铜死亡相关基因在RA中表达情况
通过检索GEO数据库得到物种为人的RA滑膜基因表达数据集GSE89408。数据集基于芯片GPL11154，包括对照组样本28例，RA样本152例。基于GSE89408数据集，10个铜死亡相关基因表达差异分析结果显示（图1-A），与正常对照组相比，RA组关节滑膜FDX1、DLD、DLAT、LIAS、GLS、LIPT1、MTF1、PDHA1和PDHB表达上调且差异具有统计学意义（P＜0.05）。
2.2 铜死亡相关基因表达分型
基于10个铜死亡相关基因在RA样本关节滑膜表达情况，将152例RA滑膜样本进行一致性聚类分析（图1-B），分为RA1和RA2 2种亚型。主成分分析（principal component analysis，PCA）结果显示（图1-C），RA1与RA2 2种亚型间存在差异，可用于进一步分析。铜死亡相关基因在RA1和RA2 2种亚型表达差异分析结果显示（图1-D），与RA1组相比，RA2组CDKN2A、FDX1、DLD、DLAT、LIAS、GLS、LIPT1、PDHA1和PDHB表达下调且差异具有统计学意义（P＜0.05）。
2.3 差异分析结果
基于数据集GSE89408将RA组与正常对照组相比，根据DEGs筛选条件，共得到10 558个RA滑膜DEGs（图2-A）。铜死亡2个亚型RA1与RA2分组间差异分析共得到652个DEGs（图2-B）。对2次差异分析结果进行交集分析，得到501个共同DEGs。
2.4 通路富集分析结果
501个共同DEGs通路分析结果（图2-C）显示，趋化因子（chemokine）信号通路、Toll样受体（Toll-like receptor）信号通路、白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信号通路、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路、p53信号通 路和过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisomeproliferators-activated receptor，PPAR）信号通路与铜死亡相关，在RA病理过程中发挥重要作用。
2.5 免疫浸润分析结果
免疫浸润分析结果显示，与正常对照组相比（图3-A），RA组关节滑膜样本中记忆B细胞（B cell memory，P＜0.001）、浆细胞（plasma cells，P＜0.05）、未活化的记忆CD4+ T细胞（T cells CD4 memory resting，P＜0.000 1）、活化的记忆CD4+ T细胞（T cells CD4 memory activated，P＜0.000 1）、滤泡辅助性T细胞（T cells follicular helper，P＜0.05）、调节性T细胞（T cells regulatory，P＜0.000 1）、γδT细胞（T cells gamma delta，P＜0.05）、静息自然杀伤（natural killer，NK）细胞（NK cells resting，P＜0.01）、活化NK细胞（NK cells activated，P＜0.000 1）、单核细胞（monocytes，P＜0.05）、M1型巨噬细胞（macrophages M1，P＜0.000 1）、静息树突细胞（dendritic cells resting，P＜0.05）、静息肥大细胞（mast cells resting，P＜0.01）和中性粒细胞（neutrophils，P＜0.000 1）丰度存在差异。
RA1组与RA2组免疫浸润分析结果（图3-B）显示，两组间初始CD4+T细胞（T cells CD4 naive，P＜0.01）、活化的记忆CD4+ T细胞（P＜0.05）、静息NK细胞（P＜0.05）、M2型巨噬细胞（macrophages M2，P＜0.001）、嗜酸性粒细胞（eosinophils，P＜0.05）和中性粒细胞（P＜0.01）丰度存在差异。
2.6 铜死亡相关基因诊断价值分析
结合在正常对照组与RA组及RA1与RA2组间差异表达的铜死亡相关基因，共有8个共同铜死亡相关基因（DLAT、DLD、FDX1、GLS、LIAS、LIPT1、PDHA1和PDHB）表达存在差异。借助微生信在线网页工具构建基因受试者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线，获得基因对RA诊断的灵敏度和特异度，评估基因对RA诊断价值。结果（图4）显示，DLAT（AUC＝0.862）、DLD（AUC＝0.826）、FDX1（AUC＝0.880）、GLS（AUC＝0.901）、LIAS（AUC＝0.852）、LIPT1（AUC＝0.851）和PDHB（AUC＝0.857）特异性较高。此外，PDHA1（AUC＝0.658）特异性较低。
2.7 相关性分析结果
7个共同铜死亡相关基因与3个共同差异免疫细胞（活化的记忆CD4+ T细胞、静息NK细胞和中性粒细胞）相关性分析结果如图5所示，DLAT、DLD、FDX1、GLS、LIAS、LIPT1和PDHB之间表达相关性均为正相关（r＞0.05）。活化的记忆CD4+ T细胞与7个铜死亡相关基因表达均呈正相关。与之相反，静息NK细胞与7个铜死亡相关基因表达的相关性系数均小于0。中性粒细胞与7个铜死亡相关基因表达相关性较弱。
2.8 靶向铜死亡基因治疗RA的潜在中药及其有效成分确定
基于Herb数据库检索能靶向7个共同铜死亡相关基因的潜在中药，其中未能找到能靶向LIAS、LIPT1和PDHB基因的中药，潜在靶向DLAT、DLD、FDX1和GLS基因的治疗RA的中药如表2所示。通过检索相关文献确定中药的有效成分，无相关文献则通过Herb数据库补充。共获得7种潜在中药（草莓车轴草、虎杖叶、白罂粟、丽春花果实、水团花、粟壳和罂粟嫩苗），并确定41种有效成分。
2.9 分子对接模拟药物分子与蛋白结合
通过SwissADME在线工具共筛选出符合RO5原则的药物成分13种（表3），安全性评估结果显示咖啡酸、库明吉啶、大黄素、考迈斯托醇、阿魏酸、没食子酸和白藜芦醇毒性较低（毒性等级＞3，出现毒性反应数≤1）。以甲氨蝶呤为阳性对照。将以上7个安全性较高的成分与7个共同铜死亡相关基因进行分子对接，药物分子配体与蛋白受体结合能如图6-A所示。结合能均小于0，表明药物分子与蛋白受体有结合可能。尽管吗啡与DLAT结合能最低，但鉴于吗啡属于危险药物，成为RA治疗药物可能性较低。本研究展示其他结合能较低的构象。DLD与大黄素结合构象、库明吉啶与FDX1结合构象如图6-B、C所示。
2.10 两组受试者基线资料
最终正常对照组和RA组各纳入5例受试者。两组受试者基线资料如表4所示。
2.11 铜死亡相关基因在RA患者中mRNA表达水平
铜死亡相关基因DLD、GLS、FDX1、DLAT在健康受试者和RA患者外周血单个核细胞中mRNA表达水平如图7所示。与健康对照组相比，RA患者外周血单个核细胞中DLD、GLS、FDX1、DLAT的mRNA表达水平明显升高且差异具有统计差异（P＜0.05、0.01）。
3 讨论
铜死亡是新发现的一种细胞死亡方式，可能会影响RA中的各种细胞，从而涉及炎症、血管生成和骨破坏的发展过程[11]。本研究通过下载GEO芯片数据，对RA滑膜基因表达数据分析结果显示，大部分铜死亡相关基因在RA患者样本中表达上调，这表明铜死亡与RA的疾病进展相关。基于铜死亡基因在RA样本中的表达水平，将RA样本分为铜死亡基因高表达亚型组和低表达亚型组。对正常对照组与RA组、铜死亡基因高表达组与低表达组分别进行免疫浸润分析，确定了RA中3个与铜死亡相关的免疫细胞，分别为活化的记忆CD4+ T细胞、静息NK细胞和中性粒细胞。大量记忆CD4+ T细胞、NK细胞存在于RA患者外周血、关节滑膜与滑液中，这些细胞能够高效地产生促炎细胞因子进而导致关节炎症，同时促进骨破坏[17-18]。同样在RA环境中，中性粒细胞表达多种趋化因子受体，并释放大量炎症介质[19]。因此，靶向抑制这些免疫细胞，降低促炎细胞因子水平是一种有前景的RA治疗策略[5]。铜死亡基因与免疫细胞可能在RA免疫浸润方面发挥重要作用，能否通过调节免疫细胞死亡缓解RA症状，有待进一步研究。
基于差异分析共得到501个DEGs，KEGG通路富集分析结果显示，RA中铜死亡可能与趋化因子信号通路、Toll样受体信号通路、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、NF-κB信号通路、p53信号通路和PPAR信号通路相关。NF-κB信号通路是细胞因子与炎症反应之间的桥梁，铜元素可以通过激活NF-κB信号通路促进炎症和线粒体自噬障碍[20]。在长期铜暴露或铜诱导的条件下，p53表达增加且肿瘤坏死因子信号通路被激活，进一步促进细胞凋亡[21-22]。Liu等[23]研究显示，铜元素可能通过激活
PPAR信号通路调节脂质代谢。PPAR也已被证实对CD4+ T细胞的存活、激活和分化具有调节作用[24]。在RA中，各种趋化因子通过靶向中性粒细胞、成骨细胞、NK细胞、T细胞、软骨细胞和巨噬细胞等促进血管生成，加重关节滑膜炎症，并使关节长期处于慢性炎症环境中[25]。此外，IL-17通过与其受体结合刺激TNF-α、IL-1β、IL-6和趋化因子产生，以及NF-κB活化[25]。而NF-κB通路被认为是RA炎
症反应的主要途径之一[26]。由此可见，通过干预铜死亡相关通路促进促炎细胞群铜死亡可以有效缓解RA炎症。
铜死亡基因在RA芯片数据中表达分析结果显示，FDX1、DLD、DLAT、LIAS、GLS、LIPT1和PDHB 7个基因在2次差异分析中均为差异表达基因，提示其可能是靶向铜死亡干预RA的重要基因。目前尚无FDX1在RA中的研究报道，FDX1主要促进糖酵解和脂肪酸氧化，并改变氨基酸代谢参与炎症反应[27]。LIAS主要与线粒体功能、氧化应激和炎症有关，过表达LIAS可以增加调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）的数量并减少了T细胞浸润，抑制NF-κB活性，减轻慢性炎症反应并保护线粒体功能[11,28-29]。GLS1在RA成纤维样滑膜细胞中表达上调，抑制GLS1表达水平可以抑制RA成纤维样滑膜细胞增殖并抑制关节炎小鼠的炎症反应[30]。LIPT1主要调节线粒体呼吸、乳酸和丙酮酸的产生，并与RA患者的滑膜细胞增殖和血管生成相关[11,31]。DLAT也能通过影响线粒体功能参与RA的发展[11]。PDHB已被确定为RA的易感基因，可能与帕金森病蛋白7共同调节Treg细胞并保持其功能完整性；PDHB表达下调可能导致RA成纤维样滑膜细胞异常增殖[11]。ROC曲线分析7个重要基因，AUC值均高于0.5。以上结果表明这些基因可作为RA的诊断标志物和潜在治疗靶点。
通过检索相关数据库获得干预RA铜死亡基因的中药及其有效成分，得到7种中药及其41个有效成分。其中罂粟虽然具有敛肺涩肠、固肾镇痛等功效，但其主要成分吗啡和可待因等生物碱具有成瘾性，已被国家列入麻醉精神类药品目录严格管制[32]。本研究不探讨此类药物及相关成分。《本草拾遗》和《本草推陈》记载传统中药虎杖叶具有平肝潜阳、祛痰熄风等功效，临床上主要应用于治疗风湿关节疼痛、消炎和消肿等[15]。相关研究表明，虎杖中有效成分具有抗炎和抗痛风作用，在血管生成方面具有双重作用，且长期高剂量应用虎杖会产生毒性，造成肝脏损伤，但毒性反应具有可逆性[33]。因此，虎杖叶有成为靶向铜死亡缓解RA炎症症状治疗药物的潜在可能，但虎杖叶中发挥主要治疗作用的有效成分尚不明确，需要进一步筛选鉴定。根据RO5成药原则及毒性预测结果，筛选出咖啡酸、库明吉啶、大黄素、考迈斯托醇、阿魏酸、没食子酸和白藜芦醇7个药物成分。分子对接结果显示，这些药物成分均有与RA铜死亡靶点结合的可能。白藜芦醇已被应用于临床治疗RA，且治疗效果较好。在RA中，白藜芦醇对p53通路具有调控作用并促进成纤维样滑膜细胞、巨噬细胞和浸润的炎性细胞凋亡[34]。通过构建佐剂性关节炎大鼠模型，发现咖啡酸和阿魏酸可减轻关节炎大鼠炎症，缓解爪子水肿和炎症细胞浸润，保护关节组织免受血管翳形成以及软骨和骨破坏[35-36]。大黄素通过抑制NF-κB通路在胶原诱导关节炎小鼠中发挥抗炎作用[37]。没食子酸可降低促炎细胞因子水平并诱导成纤维样滑膜细胞凋亡[38]。在骨关节炎中，考迈斯托醇可以抑制IL-1β诱导的炎症[39]。由此可见，虎杖叶可以作为靶向铜死亡治疗RA的潜在治疗药物。
4 结论
靶向铜死亡基因促进免疫细胞死亡，从而缓解RA炎症，是一种很有前景的治疗策略。本研究分析了铜死亡基因在RA中表达水平差异，且可能与记忆CD4+ T细胞、NK细胞和中性粒细胞免疫浸润相关。同时本研究预测虎杖叶有效成分可能靶向铜死亡基因缓解RA炎症。本研究的分析结果为靶向铜死亡治疗RA的相关研究提供了新的方向和理论基础，为临床RA治疗提供新的选择药物。但研究仍存在一些问题，如未能检索到草莓车轴草有效成分及其药理作用的相关文献，有待进一步深入研究。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：杨会军，郭 响，李伟青，苏小军，田雪梅，王海东，金芳梅．靶向铜死亡相关基因治疗类风湿关节炎生物信息学分析及干预中药的预测 [J]. 中草药, 2023, 54(13):4253-4265.
转自：“如沐风科研”微信公众号
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