植物病害是制约作物生产的主要因素，对农业生产造成了巨大的经济损失，严重威胁粮食安全。植物细菌性病害具有极强的侵染性、爆发性和毁灭性，防治极为困难。例如，水稻白叶枯病是由黄单胞菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae, Xoo)引起的第一大水稻细菌性病害，能侵染水稻在内的多种禾本科作物，严重时可导致颗粒无收。尽管传统杀菌剂叶枯唑和噻菌铜能有效控制植物细菌性病害的发生，但由于长期的使用和滥用，细菌耐药性问题频频出现，其防效大大降低。而高剂量的使用往往能加剧细菌耐药性问题的发生，并造成环境污染。因此，开发一种新型高效、缓释、环境友好且作用机制新颖的智能递送系统具有独特优势。偶氮苯（azobenzene）作为一种著名的光控开关分子之一，可通过外部刺激(例如光或热)调节其生物活性。β-环糊精(β-CD)具有提高活性成分的水溶性、生物利用度和稳定性等特性，且能降低药物毒性。因此，结合非共价“锁与钥匙”原理和光药理学原理，制备一种基于β-CD且具有光刺激响应的和可调节生物膜活性的新型主-客体超分子系统，以抑制植物病原细菌的生物膜形成，从而实现对棘手的植物细菌性病害的有效管控。
2023年6月20日，贵州大学精细化工研究开发中心杨松教授团队在国际学术期刊《Advanced Functional Materials》上在线发表了题为“Photo-Stimuli Smart Supramolecular Self-Assembly of Azobenzene/β-Cyclodextrin Inclusion Complex for Controlling Plant Bacterial Diseases”的最新研究成果。贵州大学精细化工研究开发中心杨杰硕士为本论文的第一作者，杨松教授和周翔副教授为本论文的通讯作者。研究人员高产率制备了光可切换活性偶氮分子（3a），通过其与β-CD之间的主客体相互作用，构建了高效智能光响应超分子系统（3a@β-CD）。该系统克服了传统农药使用不合理造成的抗药性问题，且对多种非靶标生物无毒。这种独特的智能光响应超分子系统显著提高了其生物相容性和生物利用度，并最终通过对光刺激响应实现复合物的组装—解组装过程。同时，与传统杀菌剂叶枯唑（Bismerthiazol）和噻菌酮（Thiodiazole copper）相比，超分子给药系统可有效抑制Xoo对水稻植株的侵染，并在紫外-可见光照射后进一步降低侵染率，从而实现对活性分子3a的活性调控和可逆性缓释。因此，该研究为宿主-客体复合物作为一种可行的农药发现策略提供了新的见解，可用于克服难治性的植物细菌性病害。
首先，通过简单、绿色的合成工艺制备了高产率活性偶氮分子3a(对Xoo的EC50值为2.44 µg/mL），当紫外光（λ=365 nm）照射化合物3a 60 s后，由于3a的异构化，从而获得更高活性的顺式结构3a’（对Xoo 的EC50值为0.95 µg/mL）。同时，在紫外光365 nm和可见光450 nm交替照射下，偶氮苯单元的顺反异构化能在5 轮辐照下实现反复切换，表明3a具有良好的抗疲劳性能（图1）。荧光滴定实验表明，3a和β-CD可以以1:1的比例结合，其结合常数Ka=2.9105×104，相关方程1/ΔA=1.5952+7.8629/[β-CD]。另外，通过DLS、Zeta电位、UV-vis和TEM的表征分析，确证了超分子二元复合物3a@β-CD的组装—解组装行为（图2）：3a和β-CD可通过疏水相互作用和分子间范德华力实现其复合物组装；在UV照射后，由于转换成顺式结构的3a'与β-CD不匹配，造成二元复合物3a@β-CD的解组装，从而赋予复合物光响应的按需控制释放。
图 1 3a紫外光照前后的1HNMR谱图分析（A）和紫外可见光谱学表征(B-D)
图 2 超分子二元复合物3a@β-CD的组装与解组装分析
为了进一步明确3a作为活性分子对Xoo的作用机理，研究者通过结晶紫染色定量实验和荧光染色法，揭示了3a及所构建的主-客体3a@β-CD复合物能显著地抑制Xoo生物膜的形成（图3和图4）。上述实验证明，本研究构筑的基于环糊精-偶氮苯的超分子递送系统可有效地抑制Xoo生物膜的形成，有望克服传统农药使用不合理造成的抗药性问题，实现对棘手的植物细菌性病害的有效管控。
图 3 结晶紫染色定量分析超分子递送系统抑制Xoo生物膜的形成
图 4 荧光染色法验证超分子递送系统降低Xoo生物膜的形成
进一步，为验证所构筑的超分子递送系统的实际应用潜力，活体盆栽实验表明，3a的保护活性和治疗活性分别为41.54%和36.83%；紫外光照获得的顺式3a’的活性可提升至46.98%和43.34%；二元复合物3a@β-CD的保护活性和治疗活性为51.22%、48.37%；通过自然光照射后，处理组(UV-3a@β-CD）的保护活性和治疗活性可分别提升至55.84%和52.05%。上述的活体活性均优于商业药剂叶枯唑（保护活性：35.06%；治疗活性：31.86%）和噻菌酮（保护活性：31.74%；治疗活性：27.03%）（图5）。活体盆栽试验表明，通过主客体自组装，能显著提升活性成分的生物相容性和生物利用度，并进一步证实该策略能在自然光条件下实现对水稻白叶枯病的有效防治。
图 5 活体盆栽试验验证超分子递送系统对Xoo的防治效果
最后，为了评估所构建的超分子递送系统的生物安全性，研究者将其风险评估扩展到其他非靶标生物，通过植物毒性、细胞毒性以及对水生生物斑马鱼（Brachydanio rerio）的毒性试验表明，所构筑的超分子递送系统具有较低的毒性（图6）。
图 6 超分子递送系统对非靶标生物水稻植株的毒性评价
【主要通讯作者简介】
杨松教授：贵州大学绿色农药全国重点实验室教授，博士生导师，国家高层次人才计划入选者。国家科技进步二等奖、贵州省自然科学/科技进步一等奖获得者。先后承担国家科技支撑计划项目、863计划项目、科技部国际科技合作重点项目、国家自然科学基金项目等国家和省部级科研项目20余项。以第一或通讯作者在Nat. Protoc.,、Angew. Chem. Int. Ed.、Adv. Mater.、ACS Catal.、Appl. Catal. B Environ.、Adv. Funct. Mater.、Green Chem.、Chem. Eng. J.、Ind. Crops Prod.、J. Agric. Food. Chem.等国际重要学术期刊发表SCI论文280余篇，获发明专利授权30余件。主要研究方向为新农药创制及靶标发现、生物质催化转化等。
文章链接：
Jie Yang, Hao-Jie Ye, Hong-Mei Xiang, Xiang Zhou*, Pei-Yi Wang, Shuai-Shuai Liu, Bin-Xin Yang, Hong-Bo Yang, Li-Wei Liu, Song Yang*, Photo-stimuli Smart Supramolecular Self-assembly of Azobenzene/β-cyclodextrin Inclusion Complex for Controlling Plant Bacterial Diseases, Adv. Funct. Mater., 2023, 2303206.
https://doi.org/10.1002/adfm.202303206
转自：“高分子科学前沿”微信公众号
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