英文原题：Synthetic Site-Specific Antibody–Ligand Conjugates Promote Asialoglycoprotein Receptor-Mediated Degradation of Extracellular Human PCSK9
供稿人：覃圣男，北京大学
大家好，本期为大家介绍一篇发表于ACS Chem. Biol的文章，题目是“Synthetic Site-Specific Antibody–Ligand Conjugates Promote Asialoglycoprotein Receptor-Mediated Degradation of Extracellular Human PCSK9”。本文的通讯作者是美国马里兰大学的王来曦教授。
蛋白质降解是生物系统中维持蛋白质稳态和蛋白质质量控制的重要机制。真核生物中，包括蛋白酶体、溶酶体和自噬体在内的几个区室已被利用来进行靶向蛋白质降解。例如，Deshaies等人报道了蛋白水解靶向嵌合体(Proteolysis targeting chimera, PROTAC)，招募泛素连接酶使靶蛋白泛素化并进入蛋白酶体降解。Bertozzi等人开发了溶酶体靶向嵌合体(Lysosome targeting chimera, LYTAC），利用溶酶体靶向受体(Lysosome targeting receptor, LTR)介导靶蛋白的降解，如去唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoprotein receptor, ASGPR)。LTR配体与靶蛋白的单克隆抗体结合，可以将两者同时连接，以实现内吞并将靶蛋白靶向到溶酶体内降解。
Kexin样前转化酶枯草杆菌蛋白酶(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9)可以降低低密度脂蛋白受体(Low-density lipoprotein receptor, LDLR)水平，导致低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)水平更高，从而增加心血管疾病的风险。细胞外PCSK9与LDLR结合，诱导其内吞至溶酶体，并防止LDLR循环到细胞表面(图1 II)。本文中，作者利用LYTAC策略靶向降解细胞外PCSK9，该策略可能会提高PCSK9抗体治疗高胆固醇血症的功效(图1 IV)。
图1. 人类肝细胞中低密度脂蛋白受体（LDLR）的胆固醇调节
合成的tri-GalNAc配体已被成功用于几种肝脏靶向疗法。同时，Lee等人之前证明具有末端β-半乳糖的双分支、三分支和四分支的N-多糖能被大鼠ASGPR识别。双分支N-多糖对ASGPR的亲和力相对较弱，而三分支和四分支N-多糖的亲和力较强。这些β-半乳糖苷也是人类ASGPR的已知配体。
本文中，作者使用化学酶法Fc糖重构法，将ASGPR的天然和合成的糖配体安装在PCSK9抗体的Fc结构域中。首先，作者制备了几种天然N-多糖结构和合成的tri-GalNAc结构(图2)。通过对唾液糖肽(Sialoglycopeptide, SGP)进行蛋白酶消化以及末端唾液酸去除，作者制备了双分支的G2-Asn(1)。然后将G2-Asn与NHS-PEG5-DBCO反应，制备了G2-Asn-DBCO(2)。另一方面，作者使用牛胎球蛋白制备了三分支的G3-oxazoline(3)。同时使用蛋白酶消化牛胎球蛋白，然后阴离子交换和去唾液酸化，得到G3-Asn (4)，再与NHS-PEG5-DBCO反应得到G3-Asn-DBCO(5)。作者又将高亲和力的合成tri-GalNAc配体6与NHS-PEG5-DBCO反应获得了tri-GalNAc-DBCO(7)。
图2. 用于LYTAC方法的ASGPR配体的合成
接下来，作者将配体位点特异性连接到PCSK9单克隆抗体alirocumab (8a)上(图3)。8a用来自化脓性链球菌的固定化WT Endo-S2去糖基化，得到GNF-mAb(9a)。随后，通过9a与Endo-F3 D165A在G3-oxazoline(3)存在的情况下孵育，引入天然的三分支N-聚糖，从而得到G3F-mAb(10a)。此外，9a在di-N3-S2G2-oxazoline的存在下与Endo-S2 D184M孵育，得到11a。在WT Endo-S2存在的情况下，8a通过与di-N3-Man-GN-oxazoline孵育，转化为12a，其中叠氮基团连接在较短的双糖上。作者在11a和12a上，利用点击反应将高亲和力的ASGPR配体2、5和7安装在Fc上。2和5与11a反应，得到新的抗体13a和14a。另外，tri-GalNAc的7与11a和12a反应能够获得抗体偶联物15a和16a。
作者使用靶向表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)的cetuximab作为另一种模型抗体，发现在Fab结构域存在其他N-糖的情况下也能够进行Fc位点特异性偶联(图3)。作者将商品化的8b同样使用固定化WT Endo-S2去糖基化，得到GNF-cetuximab(9b)。Endo-S2对Fc的N-糖的去糖基化有特异性，其对Fab的N-糖基有很低的活性。然后按照类似alirocumab的方法制备了抗体10b-11b。最后使用DBCO修饰的配体2、5和7点击化学与抗体11b偶联，得到13b-15b。
图3. 化学酶法合成Alirocumab和Cetuximab的位点特异性LYTACs
作者使用流式细胞术评估上述制备的LYTACs与肝细胞表面hASGPR的结合能力(图4A)，以ASGPR的已知结合剂去唾液酸胎球蛋白(Asialofetuin)作为阳性对照。结果表明，天然的alirocumab结合很少甚至没有结合。作为阳性对照，Asialofetuin携带的半乳糖化双分支和三分支N-多糖显示出牢固的结合。这一结果证实了抗体-糖复合物与ASGPR的结合依赖于末端半乳糖或GalNAc的存在。
结果表明，10a中的三分支N-多糖直接连接到抗体的Asn上，其结合性能仅略优于天然8a，表明该位置的N-多糖无法被ASGPR识别。16a中使用较短的糖链核心，发现高亲和力的tri-GalNAc配体结合较弱。15a使用较长的糖链核心，与ASGPR的结合最强，表明与Fc结构域之间的间隔对于识别至关重要。然而在高于400 nM的浓度下结合信号降低，表明过量15a作为作为15a/ASGPR复合物的竞争性抑制剂，这种现象被称为钩效应。钩效应是一种免疫现象，当抗体或抗原的浓度非常高时，形成复合物的效力降低。最后，含有天然三分支N-多糖的14a与15a具有相似的结合能力，并且在400 nM浓度以上结合力最强，没有表现出钩效应。含双分支N-多糖的13a与细胞结合不稳定，因此未讨论。
为了更定量地评估每种糖蛋白的相对结合亲和力，我们确定了具有显著结合力的14a和15a，以及Asialofetuin的EC50(图4B)。15a的Fmax/EC50比值最高，是ASGPR的最佳结合物。14a是次优的结合物，Asialofetuin仅较弱结合，表明hASGPR可以更好地识别由长柔性链连接的三分支N-多糖。
图4. 通过HepG2细胞表面的ASGPR识别生物素化LYTAC上的多糖配体。
随后，作者使用WB检测细胞培养液中PCSK9蛋白来评估LYTACs降解细胞外PCSK9的能力。作者发现商用抗体8a未观察到显著降解(图5A)。10a和13a也不能降解细胞外的PCSK9，表明直接连接到Fc的三分支N-多糖和弱结合的双分支N-多糖是无效配体(图5B)。然而，14a能在200 nM的浓度下，降解约30%的PCSK9，表明三分支N-多糖通过长柔性链连接抗体后，可以成为有效的配体。带有tri-GalNAc的15a降解效果更为明显，约60%的PCSK9在50 nM浓度15a下被降解，相当于PCSK9的等摩尔浓度。同时也观察到钩效应，在较高的浓度下，PCSK9的降解率降低。而含天然三分支N-多糖的14a未观察到这一效应(图5C)。16a相比于15a具有较短的双糖核心，其降解PCSK9的效率较低，这可能是由于较短的糖链使tri-GalNAc配体的可及性降低。16a也具有钩效应，这种效应是含tri-GalNAc配体的LYTACs特有的。这些结果表明，14a-16a可显著降解临床相关的PCSK9蛋白，并且天然的三分支N-多糖配体可以在没有钩效应的情况下靶向降解蛋白质。
图5. 蛋白质印迹评估LYTAC处理后培养基中的PCSK9降解
作者还检测了PCSK9降解对LDLR水平的影响(图6)。首先，外源性PCSK9处理的细胞LDLR水平降低了约20%。在PCSK9处理的细胞中观察到较低分子量的双条带，这可能是由于PCSK9介导的部分LDLR蛋白水解。使用商业抗体8a处理后，LDLR水平从PCSK9诱导的降解中恢复，并且在最高抗体浓度下检测到LDLR蛋白增加17% (图6A)。而14a处理与对照相比并没有导致LDLR显著增加。然而，使用50 nM 含tri-GalNAc的15a处理使LDLR增加了40%(图6B)，并且在这个浓度下15a检测到显著水平的PCSK9降解，表明PCSK9降解恢复了LDLR水平。这些结果表明，PCSK9降解可能是LDLR上调的相关治疗途径，而LDLR负责循环LDL-C的摄取和清除。
图6. 蛋白质印迹评估LYTAC处理后HepG2细胞的LDLR水平
最后，作者使用cetuximab衍生的LYTACs用于靶向降解EGFR(图5A)。商品化的8b，合成的10b或13b都未能降解细胞表面EGFR(图7B)。14b在低至25 nM的浓度下诱导EGFR高达30%的降解。另一方面，15b在50 nM的浓度下降解了高达45%的EGFR (图7C)。为了证明降解是ASGPR依赖的，作者使用不表达ASGPR的HeLa细胞(EGFR+ ASGPR-)用8b，14b和15b处理。在任何这些处理后均未观察到EGFR降解，表明14b和15b诱导的EGFR降解是ASPR依赖的(图7D)。
图7. 含不同ASGPR聚糖配体的cetuximab的LYTAC用于降解EGFR
总结来说，作者通过化学酶法Fc聚糖重构法，实现了不同配体的ASGPR的位点特异性抗体-配体偶联物的合成，包括天然的N-多糖和合成的tri-GalNAc。作者评估了PCSK9抗体以及EGFR抗体用于蛋白降解的能力。结果表明，多糖配体的性质和连接长度对靶蛋白的降解至关重要。含tri-GalNAc的抗体在PCSK9降解中表现出明显的钩效应，即高浓度的tri-GalNAc抗体导致对受体的亲和力降低，然而含天然三分支N-多糖的抗体没有表现出钩效应。这一新发现有助于选择合适的多糖配体进行ASGPR介导的靶向蛋白降解。未来的工作应该对这些聚糖结构进行更详细的分析，以确定ASGPR介导蛋白质降解的最佳配体。最后，需要进行体内实验来评估这些配体偶联抗体对PCSK9靶向降解的临床潜力，这为治疗高胆固醇提供了一个有希望的途径。
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
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