ELISA运用了免疫学原理和化学反应显色原理，需要将抗原或抗体预包被在固相载体表面，使后来形成的抗原-抗体-酶（荧光基团）-底物复合物黏附在载体上，通过检测OD值或发光值，来检测靶蛋白的含量。ELISA适合用于定量检测胞外的分泌性蛋白，检测大分子抗原和特异性抗体等。
但是ELISA实验步骤琐碎，细节颇多，要想得到令人满意的结果还是需要花很多时间和精力去摸索实验技巧的。
小V整理了针对高频ELISA实验异常的原因，让你实验更轻松
样品
样品是检测的前提，样品质量会直接影响实验结果。可以用ELISA来检测的样品很多，根据检测项目不同可以是血清、血浆、唾液、尿液等，但大部分还是以血清为样品。作为血清样品，应避免溶血，溶血可能会增加非特异性显色，导致结果出现误差。
血清样品的反复冻融会使血清中的抗体效价下降，所以需要多次检测的血清样品，如在5d内检测完，可4℃保存，如需长时间检测，可进行分装冻存。样品如被细菌污染腐败，可能会导致假阳性。
温度
温度主要影响抗原抗体反应，酶促反应速度及非特异性吸附，温度升高可使抗原抗体结合反应加速，但也易引起抗原抗体复合物的解离。酶促反应速度同样随温度升高而增快，但是酶蛋白变性也加快，丧失酶学活性，降低酶的有效浓度而减慢反应速度，温度低时以前者为主，高时以后者为主。
温度是质量控制的一个重要方面，一般允许±1℃的误差。最好水浴，微孔板浮在水面，使温度迅速平衡。如放温箱内温育，微孔板不应叠置，为避免蒸发，板上应加盖，盛放微孔板的湿盒应是金属的，传热容易。空湿盒应预先放在温箱中，以平衡温度，在室温较低时更需要。
时间
在温度保证的前提下，时间的控制至关重要，尤其是底物显色的时间控制，显色时间不足或过长会导致实验不成立，无法对检测结果进行判断。
加人标本、试剂及混合的时间称为操作时差。操作时差在每个试验中都存在，对结果或多或少有影响。对手工操作，尤其是样品量大的项目，从加人第一个标本到最后一个标本，需几十分钟，加人试剂及混匀存在很大的时间差异，使抗原抗体和酶促反应时间不一致，易产生假阳性、假阴性结果。
因此，样品过多时，请选择分批操作，对勿须更换移液口吸嘴的酶结合物，底物的加样可选择8联或12联专用的多道加液器。亦可避免单孔滴加底物时遗漏多加。
人员操作
ELISA成品试剂盒为检测工作提供了方便，按照说明书进行操作就可以完成实验，但人为操作时候很多细节也会导致实验误差。
1. 包被
一些ELISA反应板需要自行进行包被处理，没有进行包被，或包被液使用与检测项目不同都会使实验失败。包被时，未进行震荡，孔底未被包被液全部覆盖会导致检测结果偏差。
2. 反应液稀释
稀释液使用错误或稀释比例不正确会导致实验失败或结果不准确。
3. 洗板
人工洗板时，弃去洗涤液时方法不当，易使各孔液体相互流入，导致假阳性；洗涤液使用量和洗涤次数过少导致洗涤不彻底，洗板后未拍板或拍不干净都会影响实验结果。
设备
仪器设备是ELISA实验的基础，常用的相关仪器设备包括移液器、酶标仪、洗板机和恒温箱等。所有设备都需要进行检验校准，保证准确性和精确度。
移液器的使用要尽可能选择所需加液量接近最大量程，并正确使用，减少实验误差。
酶标仪要提前开机预热，保证光源稳定；洗板机要检查加液孔是否通畅，保证加液量。
恒温箱要提前开机，开、关门要快速，保证反应温度。
试剂
试剂盒要根据要求进行保存，并保证在有效期内使用，使用前应平衡到室温。新购入的试剂盒要进行校验，检查实验是否成立，不同的试剂盒或不同批号的试剂不可混用。
显色
显色是ELISA中的最后一步反应,此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内,阴性孔可保持无色,而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。
在定量测定中,加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确。定性测定的显色可在室温进行,时间一般不需要严格控制,有时可根据阳性对照孔和阴性对照孔的显色情况适当缩短或延。
其他
封板膜封闭不严或开启时孔内液体蒸发、震出可导致各孔相互污染；操作时接触到ELISA板底导致透光度改变，影响酶标仪测量结果；
加样图省事，未认真更换移液器吸头，认为其带入标本残留量小，不易影响结果，是部分检测人员常有的心理。因此加标本时必须认真更换移移液器吸头，防止移液器吸头残留痕量产生假阳性结果。加样时应防止溅出污染其它标本。
ELISA测定中出现问题的可能原因
（非试剂盒本身的原因），总结如下：
1.弱阳性质控样本检测不出温育的时间或温度不够；显色反应时间太短；所用配制缓冲液的蒸馏水有问题。
2.测定的重复性差，这是由于测定操作引起的问题，包括：
（1）加样本及试剂量不准；孔间不一致；
（2）加样过快，孔间发生污染；
（3）加错样本；
（4）加样本及试剂时，加在孔壁；
（5）不同批号试剂盒中组分混用；
（6）温育时间、洗板、显色时间不一致；
（7）孔内污染杂物。
3.全部孔都不显色。
（1）漏加酶结合物；
（2）洗板液配制中出现问题；
（3）漏加显色剂A或B；
（4）终止剂当显色剂使用。
4.全部板孔均有显色。
（1）板不干净；
（2）显色液变质；
（3）洗板液受酶等污染.
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