标题: Resveratrol intervention attenuates chylomicron secretion via repressing intestinal FXR-induced expression of scavenger receptor SR-B1
白藜芦醇干预通过抑制肠道FXR-SR-B1轴抑制乳糜微粒分泌
期刊: Nat Commun. 2023 May 9;14(1):2656.
作者及单位 : Juan Pang#, Fitore Raka#, et al., Khosrow Adeli*, Wenhua Ling*, Tianru Jin*; 中山大学公共卫生学院营养系 / 多伦多大学
doi: 10.1038/s41467-023-38259-1.
摘要：Two common features of dietary polyphenols have hampered our mechanistic understanding of their beneficial effects for decades: targeting multiple organs and extremely low bioavailability. We show here that resveratrol intervention (REV-I) in high-fat diet (HFD)-challenged male mice inhibits chylomicron secretion, associated with reduced expression of jejunal but not hepatic scavenger receptor class B type 1 (SR-B1). Intestinal mucosa-specific SR-B1-/- mice on HFD-challenge exhibit improved lipid homeostasis but show virtually no further response to REV-I. SR-B1 expression in Caco-2 cells cannot be repressed by pure resveratrol compound while fecal-microbiota transplantation from mice on REV-I suppresses jejunal SR-B1 in recipient mice. REV-I reduces fecal levels of bile acids and activity of fecal bile-salt hydrolase. In Caco-2 cells, chenodeoxycholic acid treatment stimulates both FXR and SR-B1. We conclude that gut microbiome is the primary target of REV-I, and REV-I improves lipid homeostasis at least partially via attenuating FXR-stimulated gut SR-B1 elevation.
几十年来，膳食多酚的两个共同特点阻碍了我们对其有益作用机制的理解：多靶点和极低的生物利用度。我们的研究发现白藜芦醇干预（REV-I）抑制高脂肪饮食（HFD）下雄性小鼠乳糜微粒的分泌，与空肠但非肝脏b族Ⅰ型清道夫受体（SR-B1）的表达减少有关。肠粘膜特异性SR-B1-/-小鼠在HFD下表现出脂质稳态改善，REV-I并未进一步发挥改善作用。Caco-2细胞中的SR-B1表达不能被纯白藜芦醇化合物所抑制，而接受REV-I小鼠的粪便移植能抑制受体小鼠的空肠SR-B1。另外，REV-I减少了粪便中的胆汁酸水平和胆汁盐水解酶的活性。而在Caco-2细胞中，鹅去氧胆酸（CDCA）处理同时刺激FXR和SR-B1。综上，肠道微生物组是REV-I的主要靶点，REV-I至少部分地通过减弱FXR-SR-B1轴的上调来改善脂质稳态。
背景介绍
在过去的50年里，肥胖症的发病率在全球范围内急速上升，严重危害人类健康。
肥胖的病因主要是摄入的能量大于消耗的能量。
我们的小肠主要负责吸收营养物质，摄入的脂质在消化酶的作用下分解为脂质微粒，并在肠道上皮细胞中形成乳糜微粒经淋巴管进入血液。
血液中存在的富含脂质脂蛋白（TRL）主要为肠道来源的乳糜微粒及肝脏来源的极低密度脂蛋白（VLDL）。
血清内脂质水平与肝脏VLDL和肠道乳糜微粒的产生及清除有关。
乳糜微粒由脂蛋白脂解酶分解生成脂肪酸和乳糜微粒残留物，后者进入肝脏生成甘油三酯可能导致异位脂质蓄积。
研究表明，肠上皮细胞的脂质转运蛋白SR-B1（b族Ⅰ型清道夫受体）在高脂饮食下显著增加，抑制或敲除SR-B1能够减少乳糜微粒合成。
近年来，天然产物来源的营养膳食调节剂在治疗代谢性疾病方面发挥重要作用，包括一些黄酮类化合物。而白藜芦醇，作为一种非黄酮类多酚有机化合物，在治疗代谢性疾病方面展现疗效。主要来源于白酒或红酒、红葡萄、黑巧克力和蓝莓等食物。但由于其存在多靶点和生物利用度低的特点，因此对于其治疗代谢性疾病的机制研究尚不完善。
有研究表明，白藜芦醇减肥和降糖作用与肠道菌群相关。
那么具体机制是什么呢？
研究结果 / Result
1. 白藜芦醇干预（REV-I）减少HFD下乳糜微粒分泌进而改善代谢表型
结果显示，给予6周龄大小C57BL/6J小鼠白藜芦醇干预（REV-I；HFR）八周能够显著减少HFD引起的体重增加，改善葡萄糖和胰岛素耐受性，并伴随空腹葡萄糖和胰岛素水平的降低。
一方面，REV-I引起空腹TG显著下降，但不引起空腹游离脂肪酸变化，说明REV-I不影响脂肪脂解。使用泊洛沙姆407对过夜禁食的小鼠脂解酶进行抑制，并不影响其空腹TG水平，且空腹富含甘油三酯脂蛋白无显著变化，说明REV-I不影响VLDL生成。
另一方面，进食后血TG显著下降，富含甘油三酯脂蛋白显著降低，乳糜微粒显著减少，说明REV-I主要通过抑制进食状态下乳糜微粒的产生来减少血TG，进而改善代谢表型。
2. REV-I依赖于肠道SR-B1发挥改善HFD代谢表型的作用
肠道细胞中甘油三酯主要来源于膳食脂质吸收和从头合成，而去路主要为乳糜微粒的分泌和脂肪酸氧化，因此接下来对肠道TG的吸收和排泄作用进行分析，发现REV-I不影响HFD下TG的摄入和排泄，也不影响肠道TG的含量，说明REV-I并非通过改善肠道TG吸收来改善HFD引起的代谢表型。
接下来对脂质代谢相关基因进行分析发现，与乳糜微粒分泌相关的基因Scarb1（蛋白为SR-B1）在HFD下显著增加，而在REV-I后显著降低，蛋白结果也发现REV-I显著降低空肠SR-BI而非肝脏SR-BI，免疫组化染色和免疫荧光染色分析也证实了该发现。
为了明确SR-B1在REV-I改善HFD代谢表型中的作用，分别使用肠道特异性SR-B1敲除小鼠和SR-B1抑制剂BLT-1，结果发现在肠道特异性SR-B1敲除小鼠中HFD下REV-I改善体重及空腹血糖的作用消失，而BLT-1显著降低HFD小鼠空腹和进食后TG，并减少乳糜微粒的标志蛋白ApoB48表达，即乳糜微粒含量，而REV-I并未进一步改善HFD引起的代谢表型，上述结果提示REV-I依赖于肠道SR-B1发挥改善HFD代谢表型的作用。
3. REV-I通过肠道菌群介导的作用抑制NF-κB-p65的转录活性并降低空肠SR-B1表达
进一步对REV-I影响SR-B1的具体机制进行研究，发现REV-I启动子区域存在NF-κB-p65结合基序，而CHIP实验显示HFD提高NF-κB-p65和SR-B1结合，REV-I减少其结合，同时蛋白印迹实验显示REV-I还显著影响炎症小体通路。上述结果说明，REV-I通过抑制NF-κB-p65的转录活性降低空肠SR-B1表达。
体外实验显示，REV-I不能显著增加Caco-2细胞中NF-κB-p65-SR-B1信号通路，说明REV-I不直接作用于NF-κB-p65-SR-B1。而在transwell里构建体外肠道屏障模型后对细胞释放BODIPY C12进行分析，发现REV-I并不直接影响乳糜微粒的分泌。
进一步将HFR小鼠粪便进行匀浆，并将匀浆液进行体外给药发现，HFR小鼠粪便匀浆液能够显著降低NF-κB-p65-SR-B1信号通路水平，减少乳糜微粒分泌，而95度加热后的粪便依旧具有减少SR-B1表达的作用，上述结果表明，REV-I通过肠道菌群产生的热稳定代谢产物抑制NF-κB-p65-SR-B1信号通路水平。
为了确定肠道菌群在白藜芦醇改善HFD中的作用，接下来进行了为期12天的3次FMT实验。结果显示，短期FMT对代谢表型并无改善作用，进食后TG反而在给予HFD粪便灌胃+REV灌胃给药组（LFD-HFD-FMT+R）中显著增加，说明白藜芦醇本身在短期内不具有改善脂质稳态作用。
另一方面，乳糜微粒的标志蛋白ApoB48及脂质转运蛋白SR-B1在HFD-HFR-FMT组均显著降低，上述结果表明REV-I小鼠粪便灌胃对乳糜微粒的影响早于REV-I对于代谢表型的影响。
4. REV-I显著降低粪便中胆汁酸含量，且富含BSH酶的肠道菌群丰度下降
REV的菌群代谢产物主要为DHR和Lunularin，体外进行上述两种代谢物给药发现其并未显著增加SR-B1及NF-κB-p65基因（SCARB1及RELA）及其下游基因表达。
非靶向代谢组学结果显示REV-I显著影响HFD小鼠代谢物谱，排名前十的差异代谢物大部分功能未知，将其中之一4-羟基黄酮体外给药发现并未有增加SR-B1表达的作用。
为了寻找肠道菌群相关的作用机制，进一步进行KEGG通路分析，结果显示REV-I显著影响鞘脂代谢及胆汁酸代谢，代谢物分类显示subclass3化合物具有REV-I后降低的趋势，并在加热后无显著变化，该趋势印证了热稳定性代谢产物在其中发挥作用这一发现。Subclass3主要为鞘脂类、胆汁酸（BA）和某些氨基酸，其中以胆汁酸脱氧胆酸DCA及鹅去氧胆酸CDCA变化较为显著。
对REV-I小鼠粪便进行胆汁酸分析，结果显示REV-I显著降低粪便中总胆汁酸、CDCA及DCA含量，血清中HFD组非结合型胆汁酸、胆酸、鹅去氧胆酸和石胆酸显著增加，结合型胆汁酸TCA, TαMCA和TDCA显著下降，值得注意的是，REV-I显著逆转CDCA和TCDCA变化。另一方面，肝脏胆汁酸相关基因分析结果显示，REV-I显著增加介导CDCA转化为α-MCA的代谢酶Cyp2c70表达，而肠道中介导TCDCA转化为CDCA的BSH酶活性下降，这些发现与REV-I显著逆转CDCA和TCDCA变化相一致。
对上述小鼠的粪便进行16s测序，结果发现粪便中厚壁菌门(Firmicutes)下降，拟杆菌门(Bacteroidetes)升高，B/F比例增加；富含BSH菌丰度下降，而盲肠内容物中菌群多样性增加，富含BSH菌丰度下降，说明REV-I通过减少产生BSH的肠道微生物群抑制粪便中的胆汁酸水平。
5. REV-I通过抑制肠道FXR-SR-B1信号通路抑制乳糜微粒分泌
有研究表明，肝细胞中FXR能够直接调控SR-B1。为了验证肠道中是否存在该作用，使用FXR拮抗剂植物甾醇（Gug）和NF-κB抑制剂QNZ进行体外给药，发现REV-I能够抵消FXR激动剂CDCA对于FXR及SR-B1的上调作用，Gug和QNZ可以抵消CDCA对于NF-κB-p65的作用，证实CDCA通过FXR上调SR-B1。而体内给予FXR激动剂GW4064显著增加血TG和乳糜微粒，并显著提高空肠SR-B1表达水平，抵消REV-I作用。上述结果提示REV-I通过降低FXR-SR-B1轴表达降低乳糜微粒分泌，进而改善代谢表型。
总结：
白藜芦醇一方面通过改变肠道菌群组成，减少非结合型胆汁酸，降低FXR-SR-B1通路，另一方面通过NF-κB-p65的调控作用降低SR-B1表达；通过降低SR-B1减少乳糜微粒的分泌，从而改善HFD引起的代谢紊乱。
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