急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是由遗传因素和环境因素共同作用引起的一种常见的心血管疾病，具有高患病率、高死亡率和高致残率的特点，已超过癌症成为威胁人类健康和生命最大的疾病[1-3]。目前临床治疗AMI方法虽取得一定疗效，但AMI致死率和致残率仍然很高，治疗结果仍不理想。究其主要原因是AMI患者心室重构导致患者心脏功能不可逆损害[4-5]。因此，目前迫切需要寻找抑制AMI患者心室重构的新靶点及其药物，为治疗AMI提供新的临床策略和思路。
微小RNA（microRNA，miRNA）是一类非编码小分子RNA，是转录后水平基因表达调控过程中重要的调节因子。miRNA参与生物多种生理过程的调节，如细胞增殖、分化、凋亡等，且广泛参与生命过程与疾病发生和发展[6-7]。miRNA还可参与心肌纤维化、心肌肥厚等心血管疾病的病理生理变化过程，促进或抑制心肌细胞死亡，调节缺血后新血管形成。目前大量的miRNA被发现参与了心室重构的发生发展过程，包括miR-144、miR-133、miR-99a、miR-30及miR-34等[8-9]。Pan等[10]发现M3亚型乙酰胆碱受体可通过抑制miR-376b-5p来发挥心肌保护作用。研究报道，iv miR-144能够调控细胞自噬，降低纤维化，进而对AMI小鼠心室重构具有促进作用[11]。炎症反应能引起AMI病理过程中的心室重构。炎症是AMI患者的心室重构和心肌纤维化的主要病理机制之一。研究表明，心肌梗死后会导致内源性免疫系统激活，导致炎性介质的大量释放，进而促使炎性细胞的迁移，加速心肌细胞的再次损伤，释放大量的炎性物质，加速心肌组织纤维化和心肌细胞凋亡[12-13]。这为其他miRNA缓解或防治AMI小鼠心室重构提供了理论和实验基础。
丹参酮IIA[14-15]靶向miRNA对多种心血管疾病颇具疗效，这为治疗AMI心室重构提供了新的视角和机遇。本课题组前期研究发现，miR-376b-5p在逆转老年自发性高血压大鼠大鼠左室重构中发挥重要作用，且已证实过表达miR-376b-5p可消除丹参酮对自发性高血压大鼠大鼠心室重构的改善效果，表明miR-376b-5p表达是大鼠心室重构重要途径，这为miR-376b-5p在AMI大鼠心室重构提供了研究基础[16]。因此，miR-376b-5p可作为治疗AMI大鼠心室重构重要靶点。但miR-376b-5p调控AMI大鼠心室重构具体机制尚不清楚。因此，本研究拟探究丹参酮IIA以及miR-376b-5p在改善AMI大鼠心室重构中的作用及其作用机制。
1材料
1.1动物
SPF级雄性SD大鼠50只，8周龄，体质量220～240 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号SCXK（泸）2020-0007。SD大鼠于内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院动物实验中心SPF级实验动物室饲养，每笼5只，温度22～25 ℃，相对湿度60%～70%，自由进食饮水。动物实验经内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院医学伦理委员会批准（批准号BYYFY-2022-0008）。
1.2药品与试剂
丹参酮IIA磺酸钠注射液（批号H31022558）购自上海上药第一生化药业有限公司；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）试剂盒（批号H052-1-1）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）试剂盒（批号H002-1-1）、磷酸肌酸激酶同工酶（creatine kinase-myocardial band，CK-MB）试剂盒（批号H197-1-1）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒（批号A020-2-2）均购自南京建成生物科技有限公司；兔抗I型胶原蛋白（collagen type I，Col1）抗体（批号YT6135）、兔抗α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗体（批号YT5053）、兔抗SMAD家族成员2（SMAD family member 2，Smad2）抗体（批号YM3364）、兔抗Smad3抗体（批号YT4334）、兔抗磷酸化SMAD2（phosphorylated Smad2，p-Smad2）抗体（批号YP0362）、兔抗p-Smad3抗体（批号YP0585）、兔抗Smad7抗体（批号YN2330）、兔抗Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶1（Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase 1，ROCK1）抗体（批号YT4162）、兔抗ROCK2抗体（批号YT4163）、兔抗纤连蛋白（fibronectin，FN）抗体（批号YM3137）、兔抗转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）抗体（批号YT4632）、兔抗同源基因家族成员A（Ras homolog gene family member A，RhoA）抗体（批号YT4077）、鼠抗III型胶原蛋白（collagen type III，Col3）抗体（批号YM6374）、鼠抗β-actin抗体（批号YM3028）均购自ImmunoWay Biotechnology公司；HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（批号D110058）、HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体（批号D110087）、HRP标记的链霉卵白素工作液（批号D111054）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，批号B600036）、BCA蛋白测定试剂盒（批号C503021）、二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）试剂盒（批号C520017）均购自上海生工生物工程（上海）股份有限公司；高表达miR-376b-5p的慢病毒载体购自上海誉宴生物技术服务中心；miR-376b-5p模拟物（miR-376b-5p mimics：F: 5’-GGGTGGATATTCC- TTCTA-3’，R: 5’-TTTGGCACTAGCACATT-3’）、miR-376b-5p抑制物（miR-376b-5p inhibitor：5’-AAACAUAGAAGGAAUAUCCACG-3’）由上海吉凯基因公司合成。
1.3仪器
BH-2型光学显微镜（日本Olympus公司）；QuantStudio 6 Flex qRT-PCR仪（美国ABI公司）；MultiskanGo 1510型全波段酶标仪（美国Thermo公司）；Power Pac 1645050型免疫印迹组件、TransBlotSD 1703940型垂直电泳转印系统、Universal Hood-II型凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）。
2方法
2.1AMI大鼠模型建立、分组和给药
SD大鼠适应性饲养1周后，随机分成假手术组、模型组、丹参酮IIA（5 mL/kg）组、miR-376b-5p mimics＋丹参酮IIA组和miR-376b-5p inhibitor＋丹参酮IIA组，每组10只。采用大鼠冠状动脉前降支结扎法构建AMI大鼠模型，假手术组除不结扎外其余步骤均同造模组。AMI心室重构模型成功后，丹参酮IIA组ig丹参酮IIA磺酸钠注射液，1次/d，连续12周；miR-376b-5p mimics＋丹参酮IIA组和miR-376b-5p inhibitor＋丹参酮IIA组分别先将大鼠转染miR-376b-5p mimics载体和miR-376b-5p inhibitor载体，按上述造模方法构建动物模型，以标准饲料喂养，造模成功后ig丹参酮IIA磺酸钠注射液，同时尾iv 0.1 mL miR-376b-5p mimics载体或miR-376b-5p inhibitor载体，1次/d，连续12周[16]。
2.2ELISA检测大鼠血清中炎症因子水平
给药结束后，按照Hou等[17]方法收集各组大鼠腹主动脉血清，按照ELISA试剂盒说明书检测血清中TNF-α、IL-1β水平和LDH、CK-MB活力。
2.3大鼠心脏组织病理及纤维化程度观察
处死大鼠，每组随机选取5只大鼠摘取左心室，用4%多聚甲醛固定后分离并包埋在石蜡中，4 µm切片。随后按照Shi等[18]方法将心脏样本分别进行苏木素-伊红（HE）染色和Masson染色，于显微镜下观察并拍照，评估心脏组织病理变化和心肌细胞纤维化程度。
2.4免疫组化检测心肌组织Col1、Col3和α-SMA蛋白表达
取心肌组织切片，脱蜡、水化，滴加30 mol/L过氧化氢于室温下孵育10 min；切片置于枸橼酸盐缓冲液中，95℃加热10 min后室温冷却；用3%双氧水孵育30 min，1% BSA孵育30 min，分别滴加兔抗Col1抗体（1∶300）、兔抗Col3抗体（1∶200）和兔抗α-SMA抗体（1∶200），37 ℃孵育1 h；然后在37 ℃下加入HRP标记的二抗孵育1 h，利用DAB检测免疫反应活性。切片用苏木素染色，利用光学显微镜进行拍照，采用Image J 13.0软件测定染色阳性细胞吸光度（A）值。
2.5qRT-PCR检测心肌组织miR-376b-5p表达
按照试剂盒说明书提取心肌组织总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。引物序列：miR-376b-5p上游引物5’-GGGTGGATATTCCTTCTA-3’，下游引物5’-TTTGGCACTAGCACATT-3’；GAPDH上游引物5’-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3’，下游引物5’-GACGCCAGTAGACTCCACGACA-3’。
2.6Western blotting检测心肌组织TGF-β1/Smad和RhoA/ROCK信号通路相关蛋白表达
取各组大鼠心肌组织，加入RIPA裂解液提取蛋白，采用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入一抗4 ℃孵育过夜后，孵育二抗，采用凝胶成像仪拍照。
2.7统计学分析
采用SPSS 22.0进行数据处理和统计学分析，数据均以表示，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）法进行多组间差异分析。
3 结果
3.1丹参酮IIA抑制AMI大鼠心肌组织中miR-376b-5p表达
如图1所示，与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中miR-376b-5p mRNA表达显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，丹参酮IIA组和miR-376b-5p inhibitor＋丹参酮IIA组心肌组织中miR-376b-5p mRNA表达水平显著降低（P＜0.05），且miR-376b-5p inhibitor＋丹参酮IIA组miR-376b-5p mRNA表达量接近假手术组，miR-376b-5p mimics＋丹参酮IIA组miR-376b-5p mRNA表达水平无显著差异，表明丹参酮IIA能够显著抑制AMI大鼠心肌组织中miR-376b-5p mRNA表达。
3.2丹参酮IIA抑制AMI大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平和CK-MB、LDH活性
如图2所示，与假手术组比较，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平和CK-MB、LDH活性均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，丹参酮IIA组和miR-376b-5p inhibitor＋丹参酮IIA组血清中TNF-α、IL-1β水平和CK-MB、LDH活性均显著降低（P＜0.05），且miR-376b-5p inhibitor＋丹参酮IIA组接近假手术组，miR-376b-5p mimics＋丹参酮IIA组以上指标无显著差异。
3.3丹参酮IIA改善AMI大鼠心肌组织形态变化
如图3所示，HE染色可见假手术组大鼠心肌组织形态正常，心肌细胞排列规则、整齐、细胞间隙小；模型组大鼠心肌组织中心肌细胞排列紊乱，心肌纤维断裂、细胞间隙大；丹参酮IIA组心肌组织的病理学变化得到了显著改善；miR-376b-5p＋丹参酮IIA组心肌组织的病理改变较模型组并没有明显变化；miR-376b-5p抑制剂＋丹参酮IIA组心肌组织的病理改变接近假手术组，且较丹参酮IIA组的改善效果更佳，表明丹参酮IIA能够抑制AMI大鼠心肌组织的病理改变。
Masson染色可见，假手术组大鼠心肌组织未见胶原纤维增多；模型组大鼠心肌组织有明显的胶原纤维增生、沉积；丹参酮IIA组心肌组织胶原沉积明显减少，显示出丹参酮IIA对AMI大鼠心肌组织的保护作用。miR-376b-5p mimics＋丹参酮IIA组心肌组织胶原纤维沉积较模型组无明显变化；miR-376b-5p抑制剂＋丹参酮IIA组心肌组织胶原纤维沉积接近假手术组，且较丹参酮IIA组的改善效果更佳，表明丹参酮IIA能够抑制AMI大鼠心肌组织胶原纤维沉积形成。
3.4 丹参酮IIA降低AMI大鼠心肌组织Col1、Col3和α-SMA蛋白表达
如图4所示，与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中Col1、Col3和α-SMA蛋白表达均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，丹参酮IIA组和miR-376b-5p inhibitor＋丹参酮IIA组心肌组织中Col1、Col3和α-SMA蛋白表达均显著降低（P＜0.05），且miR-376b-5p inhibitor＋丹参酮IIA组接近假手术组，miR-376b-5p mimics＋丹参酮IIA组以上蛋白表达无显著差异。
3.5丹参酮IIA调控AMI大鼠心肌组织中TGF-β1/SMAD和RhoA/ROCK信号通路相关蛋白表达
如图5所示，与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中TGF-β1、p-Smad2/3、RhoA、ROCK1、ROCK2和FN蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05），Smad7蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，丹参酮IIA组和miR-376b-5p inhibitor＋丹参酮IIA组心肌组织中TGF-β1、p-Smad2/3、RhoA、ROCK1、ROCK2和FN蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05），Smad7蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），miR-376b-5p mimics＋丹参酮IIA组以上蛋白表达无显著差异。
4 讨论
AMI是一种严重的冠状动脉心脏病，每年死亡人数约占全球死亡人数的1/3；而心室重构是AMI基本病理过程，会造成大量心肌细胞纤维化，导致心脏功能障碍，最终导致患者死亡[19-20]。研究表明，丹参酮IIA能够可降低心肌细胞凋亡，逆转AMI心肌细胞损伤[21-22]。本研究发现，丹参酮IIA能够改善AMI模型大鼠心肌组织病理形态，减轻心肌组织纤维化程度的发生。心肌细胞凋亡和纤维化是心室重构的一种重要病理改变，表明丹参酮IIA可以改善心肌纤维化和心肌损伤进而抑制心室重构。然而，当同时给予AMI模型大鼠miR-376b-5p抑制剂时，AMI模型大鼠心肌组织miR-376b-5p表达显著降低，心肌细胞凋亡和纤维化程度明显改善，表明丹参酮IIA与miR-376b-5p抑制剂联合应用能够明显改善AMI模型大鼠心肌组织病理性改变。
在炎症反应中，IL-1β和TNF-α等炎性细胞因子是启动级联炎症反应的关键因素。细胞释放IL-1β和TNF-α能诱发心肌细胞活力下降和凋亡，加速心肌组织分泌大量胶原蛋白和心肌纤维化，损伤心肌功能，诱发CK-MB和LDH的过表达，CK-MB和LDH是心肌损伤的重要标志物，进而造成心室重构等[23-25]。研究表明，miRNA参与心室重构的发生发展过程。本课题组前期已经发现miR-376b-5p在逆转老年自发性高血压大鼠左室重构中发挥重要作用。本研究发现，丹参酮IIA能够调节AMI模型大鼠心肌组织miR-376b-5p的表达，并能够改善心肌组织细胞的形态，抑制AMI模型大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平及CK-MB、LDH活力，减少心肌组织Col、Col3和α-SMA蛋白表达。然而，当同时给予AMI模型大鼠miR-376b-5p抑制剂时，AMI模型大鼠的炎症因子、心肌损伤标志物、胶原蛋白和α-SMA蛋白表达同时降低，表明丹参酮IIA与miR-376b-5p抑制剂具有类似效果。
在心室重构的生理过程和病理过程中，TGF-β1/Smad信号通路都发挥着重要作用[26]。TGF-β1能够促进组织纤维化，加速组织损伤。研究表明，Smad7是TGF-β1/SMAD信号通路的关键调节蛋白。TGF-β1的磷酸化能够促进Smad2/3的磷酸化，进而抑制SMAD7参与心室重构[27-28]。同样，RhoA/ROCK信号通路也是调控肌动蛋白骨架的组装、增殖、分化等过程的关键途径。研究表明，心肌损伤后RhoA蛋白能够介导机体ROS的产生，加速机体心肌细胞损伤的恶性循环，并能够诱导核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的活化，进一步激活TGF-β1、IL-6等炎症因子的分泌，又可加速TGF-β1/Smad信号通路的活化，加速恶性循环，导致大量炎症因子堆积[29-30]。本研究显示，丹参酮IIA能够调节AMI大鼠心肌组织中TGF-β1/Smad和RhoA/ROCK 2条信号通路中相关蛋白的表达；当同时给予AMI模型大鼠miR-376b-5p抑制剂时，AMI模型大鼠心肌组织中TGF-β1/SMAD信号通路和RhoA/ROCK信号通路相关蛋白表达与仅给予丹参酮IIA结果一致。这表明丹参酮IIA改善AMI可能是通过调节miR-376b-5p的表达，进而发挥作用的。
综上，本研究联合丹参酮IIA和miR-376b-5p抑制剂治疗发现，丹参酮IIA和miR-376b-5p抑制剂具有类似效果，能够抑制miR-376b-5p表达、心肌细胞损伤和纤维化，并能够同时抑制机体炎症、TGF-β1/Smad和RhoA/ROCK信号通路活化，进而改善心室重构。丹参酮IIA可能通过调节miR-376b-5p，在改善心室重构过程中发挥重要作用。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：胡月华，陈 强，邢海生，陈丽珠，郭晓华，任星星．丹参酮IIA通过抑制miR-376b-5p降低急性心肌梗死大鼠致炎细胞因子分泌并减轻心肌损伤研究 [J]. 中草药, 2023, 54(12):3887-3894.
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