Molecular Cell | 单碱基编辑工具高通量筛选靶标基因功能的应用综述

蛋白质的结构和功能对理解分子生物学的许多方面有着极其重要的作用。了解蛋白质的结构可以帮助我们更好地理解它们是如何在细胞中发挥作用的。近年来，研究者开发的单碱基编辑工具CBE（Cytosine Base Editor）和ABE（Adenine Base Editor）被用于原位高通量的基因编辑筛选：通过直接干扰活细胞内源蛋白质来研究蛋白质序列-功能关系。这些研究揭示了与疾病相关突变的影响，发现了新的药物抗性机制，并为蛋白质功能提供了新的见解。

近日，哈佛大学的Brian B. Liau在Molecular Cell 发表了题为“Base editor screens for in situ mutational scanning at scale”的综述文章。在文中，作者讨论了“基因编辑高通量筛选”方法如何应用于各种生物学问题，并与其他技术进行了比较，描述了必须解决的新挑战，以及如何最大限度地发挥其作用。鉴于其在蛋白质组中对突变进行分析的广泛适用性，基因编辑筛选有望彻底改变研究蛋白质的方式。

传统的CRISPR-Cas9技术在基因组靶标位点造成双链断裂（DSB），这些断裂通过细胞修复途径产生插入缺失（indel）突变。为了使用CRISPR-Cas9引入精确的突变，研究人员必须首先创建DSB，然后利用细胞同源定向修复（HDR）途径将外源序列整合进来。这个过程的效率有限（通常仅限于分裂细胞），且会产生不需要的突变副产物，并触发有害的DNA损伤应答信号。相比之下，碱基编辑器直接通过化学修饰基因组核苷酸来生成点突变。因此，它们能够实现精确的基因组编辑，而无需依赖HDR。

CBE和ABE的概述

 碱基编辑高通量筛选与CRISPR-Cas9类似。在典型的筛选中，研究人员设计一个sgRNA库，用于创建感兴趣的突变，例如通过在一个或多个基因上平铺sgRNA。该库被克隆到适当的载体中，并引入到细胞中。最终结果是每个细胞中包含一个不同的sgRNA，进而在蛋白质的特定部分内产生可预测的突变。下一步是选择感兴趣的表型，例如通过培养细胞使具有受损适应性的细胞消失，或通过用细胞毒性药物处理细胞来富集抗性细胞。为了获取筛选结果，通过深度测序来量化选定或对照细胞中的sgRNA丰度。根据选择后给定的sgRNA富集情况，可以判断其基因编辑突变的功能效应。这个通用的工作流程已经成为各种筛选的模板。

碱基编辑高通量筛选有望成为大规模原位研究蛋白质序列-功能关系的核心方法。当前的工具已经证明了它们在研究单个蛋白质和蛋白质集合方面的实用性，为生物学家解决各种问题奠定了基础。技术方面也有了一定的改进，如双基因编辑器、扩展靶向编辑器、sgRNA编辑结果的串联读取等，将进一步提高碱基编辑筛选的效果。

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276523004318?dgcid=author

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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