「朝搴阰之木兰兮，夕揽洲之宿莽。」，「晨兴理荒秽，带月荷锄归」。地球自转造就日月流转，昼夜更替。为适应这种规律，在宏观层面上，人类活动在时间和空间上随昼夜变化；而在微观层面上，细胞中的众多生物过程也随着昼夜节律在时间和空间上被严格调控，通过精妙地协调多种生物过程的振荡形成无形的生物钟。
2023 年 6 月 26 日， 清华大学生命科学学院、清华-IDG/麦戈文脑科学研究院、清华-北大生命科学联合中心吝易课题组与清华大学生命科学学院杨雪瑞课题组合作，在 Cell 期刊发表了题为：Circadian Clocks are Modulated by Compartmentalized Oscillating Translation 的研究论文，该研究揭示了细胞中利用相分离协调蛋白质翻译的精细时空调控，从而维持昼夜节律周期的分子机制。
研究团队首先聚焦于细胞内全局性蛋白节律性翻译的分子调控机制。在细胞节律同步化后，研究人员发现细胞内蛋白翻译存在节律性振荡且翻译高峰出现在节律时间 CT（circadian time）12-16 h。而小鼠在自然昼夜节律下，包括脑及肝在内的组织层面的蛋白翻译也存在节律性振荡。为了进一步研究调控此节律性翻译的分子机制，研究人员分析了不同节律时间的全蛋白组，并初步找到了与蛋白翻译节律振荡模式类似的 RNA 结合蛋白 ATXN2 及其同源蛋白 ATXN2L 为潜在调控因子。有趣的是，ATXN2 和 ATXN2L 单敲除的细胞节律相位向相反方向变化，显示二者在不同时间点发挥功能并协同调控蛋白翻译（图 1）。
图 1：野生型细胞、ATXN2/2L 单敲除及双敲除细胞的整体翻译激活情况
为了进一步探究 ATXN2/2L 在翻译中的调控作用，研究团队使用了多核糖体图谱分析技术（ribosome profiling），结果显示在翻译高峰时间 CT 12 与翻译低谷时间 CT 4 相比时，野生型细胞中大量基因出现明显的翻译激活，而这群基因中一大部分的翻译在 ATXN2/2L 双敲除的细胞中无法被激活，表明 ATXN2 和 ATXN2L 为节律性翻译的主调控分子。
那么下一个问题是，ATXN2/2L 如何共同起到调控节律性翻译的作用。
通过对细胞和组织的染色观察，研究人员发现 ATXN2/2L 在哺乳动物脑内中枢生物钟所在的视交叉上核（Suprachiasmatic Nucleus，SCN）以及体外培养的细胞中都会形成蛋白凝聚体（图 2）。这些凝聚体位于核周且其大小及数量随昼夜节律振荡。研究人员通过 Cryo-mill-IP 的方法分离并分析了不同时间点 ATXN2 凝聚体中的蛋白组分，结果显示，ATXN2 凝聚体依时序招募并激活一系列的生化反应，包括在 CT 12 时招募 RNA 加工相关蛋白，在 CT 16 时大量募集翻译起始因子和核糖体蛋白。
图 2：ATXN2/2L 凝聚体大小及数量在 U2OS 细胞中随昼夜节律振荡
那么 ATXN2/2L 通过相分离调控生物钟的具体分子机制是什么呢？
之前的研究表明，生物钟调控由若干分子环路组成，其中包括一组时钟基因（clock genes）构成的转录翻译负反馈回路（Transcription-Translation Feedback Loop，TTFL）。哺乳动物的 TTFL 中，转录激活因子 CLOCK 和 BMAL1 激活 PER 和 CRY 的转录，而 Per 和 Cry 蛋白异二聚体转移回细胞核，结合 CLOCK-BMAL1 并停止转录激活。后续一系列实验发现 ATXN2/2L 通过相分离参与到节律蛋白的翻译调控中。ATXN2 作为 RNA 结合蛋白，其特异性与 RNA 中的 AUUUU/A motif 结合，研究团队发现若干节律核心基因，例如 PER2 RNA 的 3' 非翻译区（3'-UTR）富含该段序列。
借助 ATXN2 体外液-液相分离（LLPS）的特性，研究团队证实 ATXN2 凝聚体能特异性招募富含该 motif 的节律分子 RNA，而其他对照相分离液滴不具备该特性。在 SCN 中，同样可以观察到 ATXN2 凝聚体与 PER2 RNA 的共定位（图 3）。
图 3：ATXN2 凝聚体在 SCN 中与 PER2 mRNA 共定位
为了建立相分离和翻译调控的因果关系，研究团队利用体外翻译系统证明 ATXN2 相分离能促进 PER2 RNA 的翻译，并且在细胞内可以直接观察到 PER2 蛋白在 ATXN2 凝聚体中合成的过程（图 4）。
图 4：利用 SunTag 技术观察 PER2 蛋白在 ATXN2 凝聚体中合成
通过对 ATXN2/2L 双敲除细胞进行回补实验，研究团队证实 ATXN2 野生型可以回补细胞全局翻译以及节律基因的振荡表型，而相分离突变体无法回补相关节律表型。
最后，研究团队将所发现机制在动物层面进行了验证。他们对野生型和 ATXN2/2L 基因敲除小鼠进行了运动节律行为检测，并比较了节律参数的变化。实验发现，在 SCN 中条件性敲除 ATXN2 或 2L 后，小鼠昼夜节律的周期长度发生相反方向的变化，而当两个基因同时敲除后，小鼠节律的稳定性显著下降。
综上所述，ATXN2 和 ATXN2L 在细胞内发生相分离，且其相分离随昼夜节律振荡。
ATXN2 和 ATXN2L 是 RNA 结合蛋白，故其相分离形成的液滴随节律振荡并依序招募和富集一系列 RNA 相关的生物过程，并在振荡高峰期募集核糖体和特异 RNA，促进关键节律蛋白的翻译。这个在翻译上的加速环节在整个转录翻译负反馈回路（TTFL）中起到了稳定和精确调控节律周期的作用（图 5）。
图 5：ATXN2/2L 相分离调控节律性蛋白翻译的分子机制模型图
相分离作为一种重要的物理化学机制，参与调控了细胞内的众多生理过程。生物大分子发生相分离并形成无膜细胞器（membrane-less organelles, MLOs），使细胞内生化反应区室化，从而对各种生理活动实现精细的时空调控。该研究揭示了相分离调节昼夜节律中翻译的功能。之前关于转录调控的研究表明，不同蛋白凝聚体在转录过程的不同阶段，包括起始、延伸和终止发挥功能。该研究中揭示的相分离对于翻译起始阶段的促进进一步支持了细胞内信息液相流动（liquid information flow）的模型。
此外，之前大多数相分离的研究系统是在生理稳态或单向转变（例如，压力以及细胞分化条件）的细胞环境下进行的。该研究中随昼夜节律振荡的相分离系统为未来研究相分离对各种细胞活动的时空调节提供全新的视角。此外，ATXN2 是一个与多种神经退行性疾病密切相关的蛋白，因此该研究也对未来的疾病研究具有指导意义，未来相关疾病的治疗应根据文中揭示的 ATXN2 凝聚体的节律振荡特性仔细考虑诊断和治疗干预的时机。
吝易实验室博士研究生庄妍榕为论文第一作者，清华大学生命科学学院博士研究生李志原、熊诗玥与孙楚杰为论文共同第一作者。
论文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.05.049
清华大学生命科学学院、清华-IDG/麦戈文脑科学研究院、清华-北大生命科学联合中心的吝易课题组长期致力于解析生物大分子相分离的性质及分子机理，并建立异常相分离与细胞死亡，尤其是与神经退行性疾病之间的关系。课题组希望利用生化、细胞及神经生物学手段，建立体内外研究模型，系统性地研究几个关键问题：1、解析细胞内无膜细胞器形成的特异性以及分子机制；2、探索生物大分子相分离对于神经系统的生理意义；3、通过人工干预的手段调控病理状态下的异常相变，最终达到治疗神经退行性疾病的目的。
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