过氧化氢酶(catalase，CAT)作为过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)的清除酶在植物生长发育和胁迫响应中扮演着十分重要的角色。CAT的功能受到严格调控，其在正常条件下维持适当浓度的H2O2作为信号分子以保证植物的生长发育；在胁迫下则消除过量H2O2以维持其稳态而增强植物耐逆性。由蛋白激酶和磷酸酶催化介导的蛋白可逆磷酸化是细胞内重要的分子开关，在生物的生长发育和胁迫响应中起重要作用。尽管已有多个蛋白激酶通过磷酸化而激活CAT的报道，但是还未见蛋白磷酸酶去磷酸化且关闭CAT的报道，其分子开关机制有待进一步探索。
2023年6月16日，湖南大学刘选明教授和林建中副教授团队及其合作者在The Plant Cell在线发表题为“The Protein Phosphatase PC1 Dephosphorylates and Deactivates CatC to Negatively Regulate H2O2 Homeostasis and Salt Tolerance in Rice”的研究论文。在该论文中，作者从水稻中鉴定了一个过氧化氢酶C（CatC）的蛋白质磷酸酶，并命名为PC1（Phosphatase of Catalase 1）。作者发现PC1能特异性去磷酸化CatC的Ser-9，促进CatC高活性四聚体解聚为低活性单体，并作为平衡耐盐和生长发育的分子开关而负调控水稻体内H2O2的稳态和耐盐性。该论文被The Plant Cell编辑部选为亮点推送论文，并且专门撰写了题为“Molecular switch to regulate salt-tolerance in rice”的推送文章。
作者采用免疫沉淀-质谱方法从水稻CatC的蛋白复合体中鉴定到磷酸酶PC1后，并用酵母双杂交、BiFC、Pull-down和Co-IP证明了PC1在体内外均可与CatC相互作用，且其作用场所为过氧化物酶体。体外去磷酸化实验发现，PC1能将CatC的丝氨酸残基去磷酸化；进一步用合成的各个已知丝氨酸磷酸化位点对应的磷酸化修饰肽段分别与PC1孵育后发现，PC1特异性去磷酸化CatC的Ser-9残基。将CatC的Ser-9进行模拟磷酸化（CatCS9D）和去磷酸化（CatCS9A）突变后进行体外酶活测定和体内互补试验，发现CatCS9D的酶活性显著提高，说明PC1通过去磷酸化CatC的Ser-9抑制后者的酶活性（图1）。
图1. PC1与CatC相互作用并特异性的去磷酸化CatC的Ser-9
为了探究Ser-9磷酸化调控CatC酶活性的机制，作者通过酵母双杂交和双荧光素酶互补试验发现，Ser-9磷酸化能够促进CatC自我相互作用，推测可能通过促进CatC四聚体形成来激活其酶活性。凝胶色谱分析发现，Ser-9磷酸化状态的CatCS9D形成更多的四聚体，表明Ser-9磷酸化的确促进了CatC的四聚体组装。蛋白结构分析发现，CatC四聚体表面有2个潜在的正电荷中心，可能是带负电荷的磷酸化Ser-9的潜在结合区域（图2）。将2个正电荷中心的氨基酸分别突变后进行酵母双杂交实验，结果发现其中的正电荷中心2（由Arg-91、Arg-215和Arg-405构成）是Ser-9的结合位点（图2）。该结果表明，CatC的Ser-9磷酸化后带上负电荷，通过与表面的正电荷中心结合来稳定CatC的四聚体结构。另外，Ser-9在生物界的CAT家族中十分保守，暗示这是一种普遍且保守的CAT聚合状态的调控机制。
图2. Ser-9磷酸化状态影响CatC四聚体的组装
随后，作者围绕PC1响应水稻盐胁迫的机制开展了一系列探究。盐胁迫和正常生长转换过程中的磷酸酶活性测定发现，在盐处理初期PC1活性急剧升高，而长时间处理则显著降低，并维持在较低水平（未处理条件下的40%）；恢复至正常条件后，PC1的酶活性又迅速升高。该结果表明，盐胁迫能够抑制PC1的酶活性，但是在盐胁迫处理初期其活性被迅速激活，推测植物细胞在遭受胁迫的早期需要迅速积累较高浓度的H2O2来激活相关的响应机制，而在长期遭受胁迫后则需要消除过量H2O2以维持其生存状态。进一步通过观察水稻种子根的生长发现，PC1在水稻由耐盐到正常生长发育状态转变的过程中起着重要的调控作用，即在盐胁迫解除后，PC1能够促进水稻由耐盐状态迅速转入正常的生长发育以完成其生活史（图3）。
图3. PC1在水稻耐盐和生长转化过程中起重要调控作用
盐胁迫表型分析发现，PC1过表达株系对盐和氧化胁迫敏感，且CAT活性较低，而H2O2积累较高；pc1敲除突变体则对盐和氧化胁迫的耐受性显著提高，且CAT活性较高，而H2O2积累显著降低。该结果表明，PC1通过影响H2O2稳态而负调控水稻对盐和氧化胁迫的耐受性。生殖生长期的盐胁迫表型分析发现，pc1突变体能显著降低因盐胁迫造成的产量损失，单株产量较野生型增产约60%，说明PC1在耐盐水稻培育中具有潜在的应用价值（图4）。于是，作者提出了PC1平衡水稻耐盐和正常生长发育的工作模式：遭受盐胁迫时，磷酸酶PC1活性被抑制，相关激酶被激活并在质膜的胞质侧磷酸化CatC，然后磷酸化的CatC转移至过氧化物酶体以形成高活性四聚体，抑制细胞内H2O2的积累，消除氧化损伤，提高水稻耐盐性；解除盐胁迫时，激酶活性被抑制，磷酸酶PC1活性升高，在过氧化物酶体中去磷酸化CatC的Ser-9，促进CatC四聚体的解聚及活性下调，维持细胞内合适H2O2含量（作为信号分子），促进水稻正常生长发育（图4）。该论文中所鉴定的PC1为解析生物界CAT如何去磷酸化而关闭的分子机制提供了可能，并且PC1作为CAT响应盐胁迫的分子开关参与了耐盐和正常生长发育平衡的调控（图4），同时也为耐盐碱水稻的培育提供了新的策略。
此外，该团队之前对蛋白质磷酸化和S-酰化修饰参与盐碱胁迫信号转导的分子机制也进行过较为系统的研究，相关研究结果均发表在植物学领域的专业国际期刊（Zhou et al., Plant Cell, 2018; Tian et al., Plant Journal, 2022）。其中，解析了一个类受体胞质激酶STRK1磷酸化CatC而正调控水稻耐盐性的分子机制，也作为亮点文章发表（Zhou et al., Plant Cell, 2018）。激酶STRK1和磷酸酶PC1功能的先后解析较为完整地揭示了CAT受可逆磷酸化调控的分子开关作用机制，为活性氧参与胁迫响应提供了新的见解。
图4. PC1调控水稻耐盐和生长发育平衡的工作模式图
刘聪博士后和林建中副教授为该论文的共同第一作者；刘选明教授和林建中副教授为共同通讯作者。袁隆平农业高科技股份有限公司杨远柱研究员团队、湖南大学郑和平教授、吉林大学左泽乘教授、北京大学何航教授和湖南农业科学院柏连阳院士也参与了该项研究。该研究得到了国家自然科学基金、湖南省重大科技专项、湖南省自然科学基金等经费的资助，同时也得到了国家耐盐碱水稻技术创新中心、杂交水稻国家重点实验室、广西水稻遗传育种重点实验室和海南省崖州湾种子实验室的大力支持。
论文链接：https://doi.org/10.1093/plcell/koad167
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