1、文献题目
Simulated Enzyme Activity and Efficient Antibacterial Activity of Copper-Doped Single-Atom Nanozymes
文献期刊：Langmuir
10.1021/acs.langmuir.2c00155
2、文献作者
杨亚玲, 昆明理工大学生命科学与技术学院，教授、博士生导师。研究领域: 合成新型纳米材料，利用分析化学、材料学、无机化学、有机化学、微生物学等多学科技术手段研究药物分析样品前处理技术和荧光探针、纳米酶用于药物分析及微生物检测及抗菌应用。
3、文献提出的科学问题
纳米酶的类POD和类OXD活性可以通过催化H2O2和O2产生ROS，后者对细菌有很强的抑制作用，因此被广泛用于抗菌、生物传感器和癌症治疗等方面。但是大多数纳米酶低的催化活性和不确定的活性部位是严重限制实际应用的两个关键因素。
4、分解为几个研究目标
1、通过盐模板法使用CuCl2、KCl和2-Melm的混合物，在高温下制备Cu-N-C单原子催化剂。
2、产物表现出表现出良好的特异性氧化酶和类过氧化物酶活性。通过催化TMB、OPD和ABTS产生的吸光度变化来验证产物的过氧化物酶活性。
3、Cu-N-C对多种细菌有极好的抑制作用，同时可以减缓耐药菌的形成。
5、研究总体方案
使用盐-模板策略合成了具有类似POD和OXD结构的Cu-N-C纳米酶，其表现出类似于天然过氧化物酶的显著的酶活性。Cu-N-C在氧化酶催化反应中可生成·OH和O2·–，具有良好的抗菌作用，并且所制备的Cu-N-C显示出良好的生物相容性。
6、方法和技术手段
SEM、TEM、XRD、UV-vis、 Fluorescence spectra、ESR spectra、XPS
7、主要研究成果
1、采用盐模板法合成Cu-N-C的TEM结果显示为典型的纳米片层结构。使用EDS确认了Cu、N和C在Cu-N-C中的元素分布，结果表明这三种元素在样品中是随机分布的。此外， Cu-N-C的XRD图仅显示了分别位于26°和42.5°的归属于碳(002)和(101)的两个衍射峰。XPS分析进一步确定Cu-N-C由Cu、N和C组成， O 1s光谱中530.3、531.1和532.3 eV分别对应于C-O、C=O和O=H。N 1s光谱中位于398.1、400.6和402.8 eV处分别为吡啶N、吡咯N和石墨N的峰。
2、许多研究报道铜化合物具有良好的氧化酶和过氧化物酶活性，已被广泛用于生物催化和细菌抑制。制备Cu-N-C后，通过催化TMB、OPD和ABTS产生的吸光度变化来验证产物的过氧化物酶活性，颜色由无色变为蓝色(652nm)、浅蓝色(420nm)和黄色(415nm)。当Cu-N-C存在时，反应体系内h2o2催化的TMB氧化增加了体系的吸光度;相比之下，对照组和仅H2O2组的吸光度变化几乎可以忽略不计，这表明系统内产生的大量ROS是由SAzyme催化氧化H2O2获得的。当反应体系为酸性时，色度和紫外吸收达到最大，说明在酸性条件下制备的Cu-N-C具有较好的类过氧化物性能。天然酶的酶活性受温度、pH值和使用次数的影响很大，在这方面纳米酶Cu-N-C具有明显的优势。在没有H2O2的条件下，Cu-N-C在相同条件下催化后表现出类似氧化的活性，可以催化TMB、ABTS和OPD。通过Km和Vmax评价Cu-N-C的催化效率。H2O2存在时，TMB的酶活性Km为0.71 mM。在无H2O2条件下，Cu-N-C对TMB的酶促活性为0.84 mM，证实了Cu-N-C具有较强的酶促活性。
3、大量报道表明活性氧在细菌抑制领域具有优异的效果和广泛的应用。基于以上对Cu-N-C活性氧活性的研究，我们研究了Cu-N-C对多种细菌的抑菌活性。通过比较菌落形成法的结果来评估材料的抗菌性能强度。弱酸性环境(pH = 6.2)并不会干扰细菌的正常生长，同样，仅存在H2O2也没有明显的抗菌作用。在相同的实验条件下，Cu-N-C-only和Cu-N-C + H2O2表现出显著的抗菌活性，LED光照60 min后，抗菌性能进一步显著增强。对于金黄色葡萄球菌，Cu-N-C + H2O2组的抑制效果分别比Cu-N-C和H2O2组高8.4和69.8%。此外，还测试了MRSA的抗菌效果，结果发现Cu-N-C对MRSA的抗菌效果比阳性对照头孢羟氨苄更明显。Cu-N-C对MRSA的MIC值为16μg/mL，与万古霉素对MRSA的MIC值1500μg/mL相比，显示出优异的抗菌性能。细菌耐药性的发展和增强是对人类健康的主要威胁。根据上述研究，CuN-C对MRSA有更明显的抑制作用，但是否能减缓细菌耐药性的发展尚不清楚。为了研究这一点，我们进行了循环抑制试验。分别用头孢丙醇、庆大霉素和Cu-N-C处理细菌，观察其耐药情况。经过8个周期后，头孢醚醇对金黄色葡萄球菌的抑制作用明显下降，细菌存活率从开始时的5.9%上升到78.6%，而Cu-N-C的细菌存活率仅从3.6上升到58.5%;同样，庆大霉素对铜绿假单胞菌的抑制作用在循环后也明显下降，细菌存活率从开始时的9.1上升到74.4%，而Cu-N-C的细菌存活率仅从7.9上升到47.1%。结果表明，Cu-N-C在抑制耐药菌和减缓耐药产生方面都表现出惊人的性能。
4、先前的研究表明，S-CDs可以穿透受损的细胞膜，但不能穿透完整的细胞膜。为了更深入、直观地证实上述结论，我们用S-CDs对Cu-N-C处理过的两种死/活细菌进行了孵育染色观察。对照组几乎没有观察到荧光图像。在Cu-N-C-only组和H2O2-only组中，仅观察到少量细菌，说明这两组对细菌的抑制作用较低。相反，在Cu-N-C + H2O2组中，可以看到大量细菌被S-CDs染色，并且可以清楚地观察到细胞形态。结果不仅表明Cu-N-C + H2O2方案具有优异的抗菌效果，而且表明Cu-N-C的优异抗菌性能是通过破坏细菌细胞膜来实现的。为了进一步观察Cu-N-C对细菌的损伤，我们对Cu-N-C + H2O2孵育处理的多种细菌进行了扫描电镜(SEM)成像。五种细菌的细胞形态在对照组中更为稳定。细菌的细胞形态为典型的杆状或典型的球形，细胞壁光滑完整。Cu-N-C + H2O2孵育处理的细菌外观有明显差异，但大肠杆菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌的细胞膜呈现出明显的褶皱和收缩，而金黄色葡萄球菌的细胞膜完全被破坏，甚至失去了球形形态。这一结果再次证明Cu-N-C通过促进ROS的释放来氧化脂质膜并破坏细菌膜。使用cv染色法评估Cu-N-C对细菌生物膜的破坏程度。结果表明，孵育48 h后，对照组和纯H2O2组形成了大量生物膜，而纯Cu-N-C处理的细菌形成的生物膜较少，而Cu-N-C与H2O2的协同作用进一步减少了细菌生物膜的形成，验证了Cu-N-C可以导致已建立的生物膜的协同破坏。
5、上述发现表明，Cu-N-C具有较强的类POD和类OXD活性。因此，使用TA作为底物验证了·OH的产生。当存在Cu-N-C时，反应体系中的H2O2催化TA的氧化，在体系中产生黄色荧光。使用TA作为底物验证了·OH的产生。当Cu-N-C存在时，反应体系中的H2O2催化TA的氧化在体系中产生黄色荧光，荧光强度的增强表明·OH的显著产生，证实了当Cu-N-C存在时反应体系中H2O2被催化产生大量·OH。使用ESR监测·OH的产生，空白对照中未产生显著信号。相反在Cu-N-C+H2O2基团中检测到·OH的强信号，这一结果再次表明，系统中·OH的产生与Cu-N-C催化H2O2密不可分。我们通过Cu-N-C催化NBT产生蓝紫红色甲基腙来验证O2·−的存在。当存在Cu-N-C时NBT的催化氧化导致系统在580nm处的吸光度增加。此外，还通过ESR监测了O2·−的产生，在反应系统中的Cu-N-C组中检测到强烈的O2·−振动，而在空白对照中没有产生显著的信号。抗菌光动力疗法（aPDT）是一种光化学疗法，依赖于非活性细菌中被可见光激活的光敏剂（PS）产生的ROS。在本研究中，Cu-N-C在LED光照射后显示出抗微生物性能的显著提高，这是因为在吸收光子后PS从单线态基态转化为短寿命单线态，随后系统间交叉形成三重态激发态。接下来通过将能量转移到氧和水分子上形成·OH、O2·−和H2O2，从而破坏细胞膜的完整性，并通过ROS导致细胞死亡。
6、通过使用MTT法测量Cu-N-C对HT29细胞活力的影响来评估Cu-N-C的生物毒性。55具体而言，用不同浓度（0−0.5 mg/mL）的Cu-N-C处理HT29细胞，并孵育4−24h。基于细胞存活率评估细胞毒性。结果表明，Cu-N-C（0.5mg/mL）孵育12h后，HT29细胞的存活率可达77.8%，表明Cu-N-C具有良好的生物相容性。使用雌性大鼠作为动物模型，灌胃给予Cu-N-C，然后进行血液取样，通过大鼠的常规血液测试来评估生物毒性。对照组和Cu-N-C + H2O2组的平均血小板体积(MPV)、血细胞比容(HCT)、单核细胞(MON)、红细胞(RBCs)、嗜中性粒细胞(GRAN)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、血红蛋白(HGB)、平均红细胞体积(MCV)、淋巴细胞(淋巴)、红细胞体积分布宽度(RDW)、血小板(PLT)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)和白细胞(WBC)的指标均在正常范围内，表明Cu-N-C不会损害血细胞。在Cu-N-C的毒性评估中，我们使用溶血分析来评估它们的生物相容性。在大鼠红细胞和Cu-N-C在37°C下孵育2小时后，Cu-N-C的溶血特性通过570 nm处的紫外吸收进行表征。即使Cu-N-C的浓度高达300 μg/mL，与Cu-N-C孵育也很少引起红细胞溶血。类似地，在Cu-N-C存在下的红细胞溶血率与PBS组相似，保持在4%以内，再次证明了Cu-N-C的生物相容性。
7、为了评估Cu-N-C应用于生物体时的抗微生物效果，使用6-8周龄的ICR雌性小鼠建立伤口感染模型。在小鼠背部制造直径为1 cm的圆形伤口，在用铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌感染24h后，用PBS、H2O2、Cu-N-C和Cu-N-C + H2O2连续九天处理伤口。仅H2O 2-没有显著促进伤口愈合，愈合率与PBS组相似，而Cu-N-C和Cu-N-C + H2O2组的伤口愈合率显著增加，并且Cu-N-C + H2O2组的伤口在第10天几乎完全愈合，反映了其优异的伤口愈合性能，伤口面积值的比较也证明了相同的结论。在治疗期间，我们记录了小鼠体重的变化，与PBS组相比，Cu-N-C + H2O2组的小鼠体重没有明显异常。此外，为了评估Cu-N-C对伤口细菌的抑制作用，对小鼠伤口上的细菌总数进行计数。H2O2没有明显的抑菌效果，而Cu-N-C抑制了铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌分别高达71.4%和82.8%，Cu-N-C + H2O2分别高达98.7%和99.916%。这些结果证实了Cu-N-C在体内没有显著的生物毒性。
8、作者给出结论
1、高金属负载的Cu-N-C富含活性Cu位点，表现出良好的特定氧化酶和过氧化物酶样活性，并且可以通过释放O2·–和·OH来显著增强抗菌活性。
2、铜氮碳对多种细菌具有优异的抑制作用，同时，可以减缓耐药细菌的形成。在伤口模型中，制备的Cu-N-C不仅加速伤口细菌的死亡，而且促进伤口愈合。
3、该材料良好的生物相容性在替代抗生素和普通抗菌材料方面具有巨大的潜力。
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