导读
岩黄连（CS）是一种传统的中国民间药物，在中国南方壮族已被用于治疗肝脏疾病。然而，CS中的主要抗肝纤维化成分尚不明确。本研究旨在阐明CS中抗肝纤维化的主要成分及其潜在机制。首先，我们应用谱效关系（SER）策略来鉴定CS中抗肝纤维化的主要成分，随后使用1H NMR代谢组学和宏基因组学测序技术来阐明巴马汀（PAL）对肝纤维化的干预作用；此外还检测了紧密连接蛋白的表达和肝脏炎症因子的水平，并通过粪群移植（FMT）验证了PAL对微生物群的影响。SER模型显示PAL是CS中最重要的活性成分。1H NMR粪便代谢组学显示，PAL可改善肠道微生物介导的肝纤维化代谢物的异常水平，如异亮氨酸、牛磺酸、丁酸盐、丙酸盐、乳酸盐、葡萄糖，这些代谢产物主要参与氨基酸代谢、肠道菌群代谢和能量代谢。宏基因组测序发现PAL可以不同程度地回调s_鼠乳杆菌，s_罗伊氏乳杆菌、s_约氏乳杆菌、s_嗜酸乳杆菌、和s_Faecacalibaculum_rodentium的丰度。此外，PAL可显著改善肠道屏障功能和肝脏炎症因子水平。FMT表明PAL的治疗效果与肠道微生物群密切相关。CS对肝纤维化的影响部分归因于PAL通过缓解代谢紊乱和重新平衡肠道微生物群。SER策略可能是发现天然植物中活性成分的有用方法。
研究热点：
1. 采用SER策略对CS中的主要活性成分进行鉴定；
2. PAL被发现是CS对抗肝纤维化的主要成分；
3. PAL可以通过改善代谢紊乱和重新平衡肠道微生物群来改善CCl4诱导的肝纤维化。
论文ID
原名：Integrating metabonomics and metagenomics sequencing to study the anti-liver fibrosis effects of palmatine in Corydalis saxicola Bunting
译名：结合代谢组学和宏基因组测序研究岩黄连中巴马汀的抗肝纤维化作用
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.195
发表时间：2023.05
通讯作者：苏志恒&梁永红&郭宏伟
通讯作者单位：广西医科大学
期刊简介
实验结果
1. 谱效关系分析
1.1 CS指纹和相似性分析
CS样品通过高效液相色谱（HPLC）进行分析。在最佳条件下，我们生成了来自不同区域的10个CS样品的HPLC指纹图（图2），采用中药色谱指纹图谱系统（2012 A版）对10批CS的指纹图谱进行相似度计算和共有峰鉴别。如表S2所示，每个样品的指纹图谱与标准参考指纹图谱之间的相似度在0.980至0.999之间。我们标记了15个共有峰，相应的峰面积显示在表S3中。共有峰的相对标准偏差（RSD%）在9.95至51.51%之间，表明从不同生产地点收集的CS的化学成分各不相同。
图1 图形摘要
CS：岩黄连，SER：谱效关系，PAL：巴马汀。
图2 10批CS的HPLC色谱图
1.2 CS减轻CCl4诱导的肝纤维化
首先，我们应用HE和Masson染色来评估肝脏的组织病理学变化。HE染色显示模型组大鼠肝索和肝小叶结构被破坏。Masson染色显示模型大鼠有明显的胶原纤维沉积和肝细胞脂肪变性。CS处理后，这些病理特征得到改善（图3A和B）。
图3 组织学和生物化学分析
（A）H&E染色。（B）Masson染色。
然后，我们通过自动生化分析仪分析血清生化指标的变化。与对照组相比，模型组大鼠谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）和球蛋白（GLB）水平显著升高，白蛋白（ALB）/GLB水平明显降低。与模型组相比，CS-1（批次1）、CS-2、CS-3、CS-4、CS-6、CS-7、CS-8和CS-10（批次10）提取物处理后，血清ALT和AST水平显著下降；所有CS处理组的血清ALP水平均显著下降；给予CS-1、CS-5、CS-8和CS-10提取物后，血清GLB水平显著降低；当用CS-1、CS-2、CS-5、CS-6、CS-10提取物处理时，ALB/GLB的水平显著增加（图4）。
图4 生化指数的水平
n=6，*（p<0.05）vs空白对照，#（p<1.05）vs模型。
1.3 谱效关系
我们对10批CS的HPLC数据中的15个共有峰的生化指标和峰面积值进行PLS分析，以确定参与抗纤维化作用的主要活性成分。对于载荷散点图，变量离轴原点越远，其在统计模型中越可能作为主要贡献。如图5A所示，峰14远离轴原点。此外，图5B展示了每种化合物的变量投影重要性（VIP）。一般认为，当VIP>1时，自变量在解释因变量方面具有显著的重要性。由于每个化合物对生化指标的贡献各不相同，因此我们使用综合加权评分来评估每个化合物对生物化学指标的总影响程度。加权计算公式如图5图例所示。如图5C所示，峰14是对药效指数有显著贡献的成分，其次是峰13、9、10和5。峰14、13、9、10和5可能是CS的主要抗肝纤维化化合物。
图5 （A）载荷散点图，（B）15个特征变量在PLS模型中的变量投影重要性图（VIP）。（C）每个化合物的综合加权得分。综合加权得分= 1/6A1+1/6A2+1/6A3+1/6A4+1/6A5+1/6A6（A1：ALT的VIP值，A2：AST的VIP值，A3：ALP的VIP值，A4：ALB的VIP值，A5：GLB的VIP值，A6：ALB/GLB的VIP值）。
接下来，我们通过使用标准品将峰14和15鉴定为PAL和脱氢卡维丁（图6）。我们之前基于谱效关系对岩黄连中HSC-T6细胞增殖抑制剂的活性成分进行了区分，结果表明巴马汀是对HSC-T6细胞增殖抑制活性贡献最大的成分。基于体内和体外药效学评估模型的谱效关系研究结果表明，巴马汀是岩黄连中潜在的抗肝纤维化活性成分。因此，我们首先选择了巴马汀进行进一步研究。
图6 （A）云南省红河州CS的高效液相色谱图。（B）混合对照品的高效液相色谱图。峰12:黄连碱，13:脱氢卡维丁，14:巴马汀，15:黄连素。
2. PAL减轻CCl4诱导的肝纤维化
HE染色显示，对照组大鼠肝小叶结构清晰完整，肝细胞呈放射状排列在中央静脉周围。在CCl4处理的大鼠中，肝细胞紊乱，肝小叶结构破坏，并且肝细胞脂肪显著变性（图7A）。Masson染色表明，对照组大鼠的胶原纤维形成最少，而模型组大鼠有许多胶原纤维（图7B）。PAL处理在不同程度上减轻了肝组织的病理变化。
图7 组织学和生物化学分析
（A）HE染色。（B）Masson染色。（C）生化指标水平，n=6。（D）COL1A1和TGF-β1的表达水平，n=3。与对照组相比，*（p） < 0.05；与模型组相比，#（p） < 0.05。
模型组大鼠的ALT、AST、ALP和GLB水平显著高于对照组大鼠（图7C）。在PAL-H处理的大鼠中，这些指标的水平显著逆转。此外，模型组大鼠COL1A1和TGF-β1的表达显著升高，PAL-H显著降低了它们的表达（图7D）。由于高剂量（108 mg/kg）PAL在改善组织学和生化测定方面有明显作用，我们选择这一剂量进行进一步研究。
3. PAL减轻CCl4诱导的代谢紊乱
代表性的1H NMR谱如图8所示。根据1H NMR谱，我们首先通过无监督PCA分析大鼠粪便样品的代谢谱。对照组和模型组的代谢谱可以清楚地区分，表明CCl4处理大鼠的代谢和生理状态发生了显著变化（图9A）。然后，我们使用有监督的PLS-DA模型进行分析，在对照组和模型组的散射点之间观察到明显的差异，这证实了PCA结果（图9B）。我们对对照组、模型组和PAL组的大鼠进行OPLS-DA分析（图9C和D），这表明这两个组彼此明显分离。模型的评估值为R2X = 0.964，R2Y = 1和Q2 = 0.85（对照与模型）和R2X = 0.909，R2Y = 0.993和Q2 = 0.783（PAL与模型），这证实了OPLS-DA模型具有不错的建模和预测能力。根据置换检验（n = 200），左边的Q2值低于右边的原始值，这证实了OPLS-DA模型没有过拟合（图S1）。因此，我们成功地开发了一个多变量统计分析模型。
图8 大鼠粪便的代表性1H NMR谱
图9 粪便代谢组学分析
（A）主成分分析（PCA）得分图。（B）PLS-DA评分图。（C，D）OPLS-DA评分图。（E）粪便中不同代谢物的相对水平。（F）1H–1H COSY谱。（G）通路分析的气泡图。N=5，与对照组相比*（p < 0.05），与模型相比#（p < 0.05）。
我们通过将核磁共振鉴定软件与相关文献相结合，鉴定出粪便中的28种代谢物（表1）。然后，我们在OPLS-DA模型中第一个主要成分使用VIP>1和P< 0.05选择了12种差异代谢物 （图9E）；使用PubChem和BMRB数据库，以及在代谢物上使用二维NMR谱确定的1H–1H相关性，确认了不同代谢物的化学式（图9F，表2）。最后，我们将12种潜在代谢物上传给MetaboAnalyst 5.0进行通路分析，富集了五个重要通路（图9G），包括：1）D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，2）牛磺酸和亚牛磺酸代谢，3）丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，4）甘油脂质代谢，5）精氨酸生物合成。根据从现有文献和《京都基因和基因组百科全书》（KEGG，www.KEGG.jp/KEGG）中获得的数据，我们基于代谢物和代谢过程之间的相互关系绘制了相关代谢途径图（图10）。
表1 粪便样本中的28种内源性代谢物
表2 与肝纤维化相关的潜在生物标志物
图10 与差异代谢物相关的代谢通路网络
红色文本表示不同的代谢物。虚线：间接关系，实线：直接关系。
4. PAL改善CCl4诱导的肠道微生物群紊乱
主坐标分析（PCoA）提供了有关肠道微生物群模式的信息。对照组、模型组和PAL处理组的总体肠道微生物群在物种水平上存在显著差异（图11A）。这些发现表明，纤维化过程以及PAL的处理过程中会显著改变肠道微生物群。
为了理解PAL如何影响肠道微生物群，我们还对每组大鼠的微生物群落组成进行了评估。在物种水平上，我们在所有样本中发现了25种相对丰度>1%的主要细菌（图11B）。在25种细菌中，CCl4处理显著降低了s_罗伊氏乳杆菌、s_鼠乳杆菌和s_约氏乳杆菌的比例，同时显著增加了s_嗜酸乳杆菌和s_Faecacalibaculum_rodentium的比例。PAL-H处理后，s_罗伊氏乳杆菌、s_鼠乳杆菌和s_约氏乳杆菌的丰度发生了不同程度的逆转（图11C）。此外，LEfSe分析结果表明，s_鼠乳杆菌、s_罗伊氏乳杆菌和s__Treponema_bryantii是对照组的优势菌群（图11D）。主要改变的肠道微生物群和代谢产物之间的Spearman相关性分析表明与肝纤维化相关的潜在代谢产物与s_鼠乳杆菌，s_罗伊氏乳杆菌和s_约氏乳杆菌呈显著正相关，而与s_嗜酸乳杆菌呈负相关（图11E）。这四种细菌的功能主要涉及“碳水化合物代谢”、“膜转运”和“氨基酸代谢”（图11F）。
图11 宏基因组测序分析
（A）物种水平的未加权UniFrac PCoA分析。（B）Circos图。（C）肠道微生物群物种水平的相对丰度。（D）LEfSe LDA得分柱状图。（E）Spearman相关性分析。（F）生物功能预测。N=5，与对照组相比*（p < 0.05），与模型相比#（p < 0.05）。
5. PAL维持肠道完整性并抑制肝脏炎症
结肠组织的HE染色表明CCl4处理对隐窝、杯状细胞和上皮细胞造成损伤。此外，炎症细胞也浸润到粘膜中。然而，PAL缓解了这些症状（图S2）。此外，在CCl4处理的大鼠结肠中，Claudin-1和Occludin的表达显著降低，而补充PAL显著增加了这种表达，表明PAL处理改善了肠道屏障（图12A）。由于较弱的肠道屏障会导致肠道来源的LPS移位，从而引发肝脏炎症，因此我们测量了肝脏LPS和炎性细胞因子的水平。如图12B所示，PAL补充大鼠的肝脏LPS、TNF-α、IL-6和IL-1β水平明显低于CCl4处理大鼠。
图12 （A）回肠组织中Claudin-1、Occludin和ZO-1的免疫组织化学染色（×40），n=3。（B）各组肝脏中LPS、TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，n=6。与对照组相比*（p < 0.05），与模型相比#（p < 0.05）。
6. PAL的抗纤维化作用依赖于肠道微生物群
我们通过移植对照组大鼠（供体）和CCl4处理的大鼠（受体）的粪便微生物群（补充或不补充PAL），使用FMT进一步评估PAL对肠道菌群纤维化的疗效（实验设计如图13A所示）。FMT 4周后，我们发现FMT-C和PAL处理供体(FMT-P)组的大鼠肝细胞脂肪变性和胶原纤维沉积减少（图13B和C）。此外，与FMT-M大鼠相比，FMT-C和FMT-P组大鼠的ALT、AST、ALP和GLB水平较低（图13D）。结肠组织中受损的隐窝、杯状细胞和上皮细胞得到改善（图S3）。总之，这些发现表明PAL的抗纤维化活性取决于肠道菌群。
图13 PAL的FMT可改善CCl4治疗大鼠的肝纤维化
（A）FMT实验的研究设计。（B）HE染色（×40）。（C）Masson染色（×40）。（D）生化指标水平，n=6。与对照组相比*p < 0.05，与模型组相比#p < 0.05。
讨论
肝纤维化是最常见的慢性肝病之一，进一步恶化可导致肝硬化或癌症。一些研究表明，肝纤维化是慢性肝病早期的一种可逆病理特征。因此，我们迫切需要开发有效、安全、经济的抗肝纤维化药物。岩黄连是一种民间药用植物，在中国常用于治疗各种肝脏疾病。目前已开发成注射剂、片剂等中成药制剂，在临床治疗肝纤维化、肝炎、肝硬化等方面具有一定疗效。前人通过UPLC-Q-TOF-MS分析，在CS中共鉴定出19种化合物，包括黄连素、巴马汀、卡维丁、脱氢卡维丁、thalictrifoline、延胡索碱、黄连碱、药根碱、表黄连碱、dehydroapocavidine、四氢非洲防己碱、dehydrodiscretamine、dehydrocheilanthifoline、碎叶紫堇碱、金黄紫堇碱、玉兰碱、深山黄堇碱、四氢小蘗碱和3-methoxy-2,9,10-three hydroxy。然而，CS的主要活性成分及其作用机制尚不清楚。
1.谱效关系分析
谱效关系（SER）是一种结合整体生物活性测试和化学计量学来寻找中药中生物活性成分的策略。气相色谱-质谱法（GS-MS）或高效液相色谱法（HPLC）通常用于鉴定成分，并利用偏最小二乘法（PLS）、支持向量回归研究成分与生物活性之间的关联，鉴定显著活性的化合物。在这项工作中，我们发现巴马汀（PAL）是对改善生化指标贡献最大的成分。因此，我们假设PAL是CS对抗肝纤维化的最重要成分。为了验证PAL的抗肝纤维化作用并探索其潜在机制，本研究采用了代谢组学分析和宏基因组学测序方法。我们发现肝纤维化与肠道微生态失调和宿主微生物群串扰改变有关。然而，PAL可以通过调节异常粪便代谢物以及肠道菌群的组成和丰度来缓解肝纤维化。
2.代谢组学分析
我们对对照组、模型组和治疗组的粪便样本进行1H NMR代谢组学分析，分别代表生理状态、病理条件和保护作用下的代谢情况。代表性的1H NMR谱如图8所示，如表1所示，我们鉴定了28种代谢物。根据VIP>1和p < 0.05的标准，我们筛选出12种潜在的代谢产物，包括异亮氨酸、乳酸盐、丁酸盐、丙酸盐、三甲胺、肌酸、牛磺酸、葡萄糖、甘油、谷氨酸、天冬氨酸和甲酸盐，主要参与氨基酸代谢（D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢；牛磺酸和亚牛磺酸代谢；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢）、肠道细菌代谢和能量代谢途径。
本研究发现D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢；牛磺酸和亚牛磺酸代谢；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢是肝纤维化过程中影响代谢的途径。先前的研究也发现，这些代谢途径在炎症和肝纤维化的发展中发挥了重要作用。在应激、疾病或受伤时，谷氨酰胺是一种条件必需氨基酸。谷氨酰胺在维持组织代谢、改善免疫反应和避免结肠炎相关纤维化发作方面具有重要意义。据报道，谷氨酰胺补充可以防止TGF-1介导的小鼠肝细胞上皮-间质转化和肝纤维化。在大多数动物组织中，牛磺酸是最普遍的游离氨基酸。牛磺酸的功能包括胆汁酸的结合、某些外源性物质的解毒、钙稳态和渗透调节。根据已发表的研究，牛磺酸可以通过增强抗氧化防御机制来保护细胞免受氧化损伤，并通过降低肝纤维化小鼠IL-6的表达来调节HSC的激活。此外，有证据表明，牛磺酸预防纤维化的能力是其影响TLR4/NF-κB信号传导能力的原因。异亮氨酸是一种支链氨基酸，有可能增强免疫系统，包括免疫器官、细胞和反应性化学物质。异亮氨酸通过增强防御素的表达，减少了几种病原体对人类和动物健康的影响。天冬氨酸是一种非必需氨基酸，通过调节氮代谢、核酸合成和Kreb循环，已在临床上用于治疗急性和慢性肝炎和肝硬化。此外，L-天冬氨酸处理激活了肝细胞和肠细胞中的LKB1-AMPK轴，增加了脂质氧化，减少了氧化应激及其引起的细胞损伤，从而改善了与代谢功能障碍相关的脂肪肝。在本研究中，谷氨酰胺、牛磺酸、异亮氨酸和天冬氨酸的减少在不同程度上被逆转，表明PAL可能介导氨基酸功能障碍，从而诱导大鼠抗纤维化。
模型组三甲胺（TMA）、丁酸盐和丙酸盐显著降低，但在PAL组水平升高。肝纤维化大鼠粪便中TMA、丁酸盐和丙酸盐的变化表明肠道菌群代谢紊乱。TMA是由肠道微生物对胆碱降解的作用形成的。TMA通常被带入内脏静脉系统，并转化为非挥发性且稳定的三甲胺-N-氧化物（TMAO）。Zhou等人揭示了微生物群代谢产物和肝血管系统通过TMAO相互作用，当这种相互作用被破坏时，NASH的肝纤维化会得到促进。丁酸盐和丙酸盐是由膳食纤维的细菌发酵在结肠中形成的短链脂肪酸，已被发现具有代谢益处。在TGF-β刺激的HSC中，丁酸盐以剂量依赖的方式降低了Procollagen1和PAI1蛋白的表达，从而阻止了纤维化的发展。在酒精相关肝病（ALD）小鼠中，补充丙酸盐可以通过抑制与肝脏炎症相关的TLR4-NF-B途径来减少肝脏损伤。与肝纤维化大鼠相比，本研究中PAL处理的大鼠TMA、丁酸盐和丙酸盐的浓度增加，表明PAL改善肝纤维化可能与肠道菌群代谢有关。
乳酸是一种羧酸，在生理pH下几乎完全离解为乳酸阴离子。此外，乳酸盐具有多种化学和代谢功能，包括降低细胞外pH值和通过肝脏中的Cori循环转化回葡萄糖。乳酸减少了免疫性肝炎小鼠的器官损伤和炎症，这表明它可能是一种很有前景的急性器官损伤免疫调节治疗方法。葡萄糖代谢异常与肝脏疾病的严重程度有关。在这项研究中，肝纤维化大鼠的葡萄糖水平显著降低，表明在肝硬化发展过程中，肝脏中的糖异生和糖酵解发生了变化，葡萄糖的消耗可以作为肝纤维化的标志之一。
3.宏基因组学测序
宏基因组测序结果表明，PAL导致肠道菌群的显著变化，PAL对肝纤维化的缓解作用可以通过FMT实验重现，这证实了PAL对肝纤维的保护作用依赖于肠道菌群。在物种水平上，s_罗伊氏乳杆菌、s_鼠乳杆菌、s_约氏乳杆菌、s_嗜酸乳杆菌和s_Faecacalibaculum_rodentium是肝纤维化期间以及PAL处理改善期间主要改变的肠道菌群。
实际上，s_罗伊氏乳杆菌、s_鼠乳杆菌、s_约氏乳杆菌都属于乳杆菌属，它是应用最广泛的益生菌之一，其促进宿主健康的作用机制主要是改善肠道屏障功能，调节肠道菌群，增加对肠上皮细胞的免疫调节作用。在增强肠道屏障功能方面，Ahl等人的一项研究表明，人类和小鼠罗伊氏乳杆菌株都可以预防和改善DSS（葡聚糖硫酸钠）诱导的结肠炎，通过在DSS处理前7天开始预防性灌胃，罗伊氏乳杆菌可以增加肠道黏液层的厚度，促进结肠上皮紧密连接蛋白的表达，从而增强肠道屏障功能。在调节肠道菌群方面，植物乳杆菌LIP-1菌株可以缓解高脂饮食引起的血脂升高，同时减少肠道菌群中产生内毒素和黏膜降解菌，增加有益菌，如短链脂肪酸产生菌。此外，就对肠上皮细胞的免疫调节作用而言，罗伊氏乳杆菌已被证明能将活性物质分泌到黏液层中，以防止细菌过度生长和入侵。在我们的研究中，PAL可以改善肝纤维化大鼠肠道细菌的紊乱，并逆转有益菌的丰度，如s_罗伊氏乳杆菌、s_鼠乳杆菌，这表明PAL可以通过调节CCl4诱导的肠道细菌紊乱来减轻肝纤维化。
进一步的相关性分析表明，肠道菌群相关的粪便代谢产物与特定的肠道菌群之间存在着密切的关系。我们发现SCFAs（丁酸盐、丙酸盐）丰度的增加与s_罗伊氏乳杆菌、s_鼠乳杆菌和s_约氏乳杆菌呈正相关。SCFAs被证明是结肠上皮细胞的主要营养来源，尤其是丁酸盐。短链脂肪酸除了作为能量来源外，还具有维持肠道屏障完整性的功能。此外，我们的研究表明，PAL可以增加CCl4处理大鼠的结肠指标Claudin-1和Occludin的表达水平，并降低肝组织中LPS、TNF-、IL-6和IL-1的水平。Han等人证明，肝纤维化小鼠的炎症标志物浓度增加，这与我们的结果一致。结合其他相关报道，我们推测PAL可能是通过调节肠道菌群、增强肠道屏障功能和抑制肝脏炎症因子，从而改善肝纤维化。
总之，我们的研究首次通过组分-活性关系策略揭示了PAL是CS体内抗肝纤维化的关键活性成分。即便如此，也不能排除CS中其他高含量的成分，如脱氢卡维丁和黄连素，也具有协同抗纤维化作用。我们需要更全面的研究来阐明CS中每个成分的确切作用。此外，肠道微生物群和代谢产物的改变在肝纤维化病因中的意义尚不清楚。PAL保肝作用的分子机制还有待利用多组学技术进一步研究。
结论
基于谱效关系策略，PAL被揭示为CS拮抗肝纤维化的关键活性成分。补充PAL可减轻CCl4诱导的病理特征，调节粪便代谢产物和肠道微生物群的紊乱，并改善肠道屏障功能。PAL通过调节“宿主-微生物代谢轴”对肝纤维化具有保护作用。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37211189/
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