中国中医科学院：冬凌草甲素靶向谷胱甘肽S-转移酶激活ROS-p38信号轴清除衰老细胞

冬凌草甲素靶向谷胱甘肽S-转移酶激活ROS-p38信号轴清除衰老细胞

本次分享的文章题目是“Oridonin acts as a novel senolytic by targeting glutathione S-transferases to activate the ROS-p38 signaling axis in senescent cells”发表在Chemical Communications上。该文章讲述了作者从19种中药活性成分中确定了冬凌草甲素作为一种选择性衰老细胞清除剂，并进一步揭示了其可能靶向谷胱甘肽S-转移酶，进而激活ROS-P38信号传导并诱导衰老细胞凋亡。

衰老细胞是一类功能失调的细胞，其主要特征是不可逆的细胞周期停滞和衰老相关分泌表型（SASP）。研究表明，衰老细胞的积累和SASP会加速机体衰老，诱发衰老相关疾病。“Senolytics”是James L. Kirkland博士团队首先提出的，由于能够选择性的清除衰老细胞，因此被视为延缓衰老和治疗衰老相关疾病的一种策略。但是，Senolytics大多是抗癌药物或其衍生物分子，而从中药活性成分中提取的Senolytics很少报道。由于许多中药活性成分具有良好生物活性和安全性，因此作者认为从一些中药活性成分中发掘Senolytics意义重大，进而展开了相关研究。

首先，作者构建了A549衰老细胞模型，并进行了β-半乳糖苷酶染色及p16、p21表达水平的检测以证明模型构建成功。接着，作者以10 μM化合物处理下衰老细胞和非衰老细胞的活力比值小于0.6为标准，以Bcl-xL特异性抑制剂A1331852作为阳性对照，对19个中药活性成分进行了筛选，结果表明冬凌草甲素比值最低（0.54），因此作者推测其可能具有Senolytic活性。然后，作者分别检测了不同浓度的冬凌草甲素在A549、HSF、HepG2和L929细胞系衰老和非衰老细胞中的活性，发现冬凌草甲素可以在相对较高的浓度下选择性地杀死衰老细胞且与细胞类型或衰老诱导方式无关。故此，作者确定冬凌草甲素为一种新的Senolytic。

冬凌草甲素具有α,β-不饱和酮结构，可以作为迈克尔加成的受体与蛋白质半胱氨酸的巯基共价结合，作者采用了基于活性的蛋白质谱学（ABPP）技术，利用半胱氨酸探针寻找冬凌草甲素的作用靶标，发现了4种属于谷胱甘肽S-转移酶（GST）家族成员的蛋白质，包括GSTK1、MGST1、GSTP1和GSTO1。然后对排名较高的GSTK1、MGST1进行了pull down、竞争性实验和酶活性测定，发现冬凌草甲素能够与GSTK1和MGST1蛋白半胱氨酸残基共价结合，并对GSTK1的酶活性抑制更为显著。此外，作者确定了冬凌草甲素在GSTK1共价结合的位点是176位半胱氨酸，对该位点进行突变后冬凌草甲素失去了与IAA-yne竞争荧光标记的能力。以上表明冬凌草甲素通过共价结合抑制衰老细胞中GST家族成员。

由于GSTs在维持细胞的氧化还原平衡方面发挥着关键作用并且在衰老A549中GSTK1蛋白的表达明显高于对照细胞，作者提出了一个假设，即GSTs的高表达有助于衰老细胞将ROS水平维持在可耐受的范围内，而冬凌草甲素能够抑制这些酶的活性，使衰老细胞以ROS依赖的方式死亡。为了验证该假设，作者首先使用了GSTO1抑制剂，发现该化合物可以选择性的清除衰老细胞。接下来作者进行了一系列反证实验证实了冬凌草甲素可以诱导衰老细胞中ROS水平，使衰老细胞发生凋亡。此外，作者还利用RNA-seq测试了冬凌草甲素处理过的衰老细胞，并对上调基因进行了GO分析，结果表明冬凌草甲素处理后p38通路被显著激活。

为了检测冬凌草甲素是否通过ROS激活的p38信号轴诱导衰老细胞凋亡。作者利用蛋白质印迹分析发现冬凌草甲素可以诱导磷酸化p38、裂解caspase-3表达水平升高，同时明显诱导p-p38的入核，在加入NAC后上述现象均发生了逆转，这说明冬凌草甲素诱导ROS的产生并激活p38信号通路。接着，作者使用了两种p38抑制剂（SB202190、BIRB796），发现它们均能拮抗冬凌草甲素对衰老A549的清除。最后，作者还对冬凌草甲素处理过的衰老细胞进行了全蛋白质组学分析，分析结果表明大多数冬凌草甲素调节的蛋白质与蛋白质磷酸化、氧化应激和细胞凋亡有关，与上述结果一致。

本文主要从中药活性成分中筛选确定了冬凌草甲素是一种新的Senolytic，然后利用竞争性的ABPP技术寻找作用靶点，并进一步阐明了其作用机制。

转自：“如沐风科研”微信公众号

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