炎症是机体对刺激产生的一种防御反应，一般对机体有利，但重度炎症则会损害机体[1-2]。多数疾病都伴随着炎症的产生，因此寻求新型抗炎药物对于治疗炎症相关疾病具有重大意义。金莲花是毛茛科植物金莲花Trollius chinensis Bge.的干燥花，为《中国药典》1977年版一部收载品[3]。该药具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌等药理活性作用，其主要由黄酮类、有机酸类、生物碱类、香豆素类等成分组成[4-5]。现代药理学研究表明，金莲花中黄酮类、酚酸类以及生物碱类等成分均能抑制炎症介质一氧化氮（NO）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的释放，从而减轻炎症反应[6]。金莲花的不同部位均具有抗炎作用，并且不同花部位总黄酮含量与抗炎活性强弱无相关性，说明有其他类型成分与黄酮类成分协同发挥抗炎作用[7]。大量临床研究表明，金莲花单味药制剂已广泛应用于治疗慢性咽炎、扁桃体炎、牙周炎等炎症疾病[8-13]，其疗效显著甚至抗炎作用高于临床常用抗炎药物[14]，可见金莲花在治疗炎症相关疾病方面具有广阔的应用前景。但是，目前对该药物发挥抗炎作用的活性成分及具体作用机制的认识尚不清晰。因此，本研究在UHPLC-Q-TOF-MS分析金莲花化学组成的基础上，结合数据网络的维度分析基因、蛋白、疾病以及药物之间的关联性，并通过分子对接进行初步验证，系统阐释金莲花发挥抗炎作用的物质基础及可能参与调控的分子机制，为金莲花药效机制的进一步研究和临床治疗提供科学的理论基础。
1 材料
1.1 仪器
UHPLC-Q-TOF-MS系统：配有二元高压泵、自动进样器、柱温箱、电喷雾离子源（ESI）、MassHunter质谱工作站（美国Agilent公司）；Heal Force Smart超纯水系统（力康生物医疗科技控股有限公司）。
1.2 药材与试剂
金莲花（亳州中药材市场，产地为河北承德，批号190718），经湖北中医药大学陈科力教授鉴定为毛茛科植物金莲花Trollius chinensis Bge.的干燥花。荭草苷（批号111777-202003）、牡荆苷（批号111687-201704）、槲皮素（批号100081-201610）、柚皮苷（批号110722-201613）对照品均购自中国食品药品检定研究院；荭草素-2ʹʹ-O-β-L-半乳糖苷（批号PS010468）、香叶木素（批号PS010395）对照品均购自成都普思生物科技股份有限公司；甲醇、乙腈（质谱级，德国Merck公司）；甲酸（色谱级，德国Merck公司）；水为超纯水，其他均为分析纯。
2 方法
2.1 金莲花化学成分分析
2.1.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取荭草素-2ʹʹ-O-β-L-半乳糖苷、荭草苷、牡荆苷、金丝桃苷、槲皮素、香叶木素6种对照品适量，置于10 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，然后用70%甲醇稀释制成含荭草素-2ʹʹ-O-β-L-半乳糖苷0.580 μg/mL、荭草苷0.505 μg/mL、牡荆苷0.910 μg/mL、金丝桃苷0.555 μg/mL、槲皮素0.535 μg/mL、香叶木素0.525 μg/mL的混合对照品溶液。经0. 22 μm微孔滤膜滤过后，即可上机检测。
2.1.2 供试品溶液的制备 取金莲花粉末约1 mg，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入70%甲醇25 mL，称重，超声30 min，用70%甲醇补足失重，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得。
2.1.3 色谱条件 Agilent Zorbax Extend C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）–甲醇（B），梯度洗脱（0～2 min，12%～33% B；2～5 min，33%～48% B；5～7 min，48%～55% B；7～12 min，55%～82% B；12～17 min，82%～92% B；17～25 min，92%～93% B）。体积流量0.3 mL/min，柱温35 ℃，进样量10 μL。
2.1.4 质谱条件 ESI 离子源，正离子检测模式，鞘气温度325 ℃，鞘气体积流量10 mL/min，喷嘴电压500 V，雾化气压力35 psi，毛细管电压4 000 V，干燥气温度350 ℃，干燥气体积流量11 mL/min，碎裂电压150 V，锥孔电压65 V，扫描范围为m/z 50～1 500。
2.2 网络药理学分析
2.2.1 金莲花活性成分的筛选及作用靶点预测 根据UHPLC-Q-TOF-MS分析结果，借助Swiss ADME平台（https://www.swissadme.ch/），以胃肠吸收的得分为“high”、类药性至少通过2个“Yes”来筛选金莲花潜在活性成分；结合相关文献研究报道，将能吸收入血、药理活性较确切的化学成分也纳入到金莲花潜在活性成分中。将筛选的化合物通过PubChem数据库（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索Canonical SMILES号，并将其输入到Swiss Target Prediction数据库（http://www.swisstarget prediction.ch/）中预测各潜在活性成分的作用靶点。利用Uniprot数据库（http://www.uniprot.org/）对预测的靶点进行校正[15]。
2.2.2 金莲花抗炎有关靶点的收集 在GeneCards数据库（http://www.genecards.org/）、DrugBank数据库（http://go.drugbank.com）、OMIM数据库（http:// www.omim.org/）、DisGeNET数据库（http://www. disgenet.org/）中以“inflammation”为关键词检索炎症相关靶点信息，取GeneCards检索结果中relevance score≥5的靶点，与其他数据库检索结果合并，删除重复项后得到炎症靶点。利用Draw Venn Diagram平台（http://bioinformatics.ugent.be/web tools/Venn/）获取炎症与活性成分交集靶点。
2.2.3 蛋白相互作用网络（PPI）网络的构建和筛选核心靶点 根据Venn分析得到的交集靶点导入STRING数据库（http://string-db.org/）中，预测交集靶点之间的蛋白互相作用关系，保存TSV文件，并将其导入Cytoscape 3.9.1中进行可视化处理，利用软件的Network Analyzer工具计算网络拓扑特征，其中度（degree）越大表示节点越重要，故而以大于degree中位数的2倍为标准筛选PPI网络中的核心靶点。
2.2.4 基因本体论（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 利用Metascape数据库（http://metascape.org/gp/index. html），输入交集靶点，设置P＜0.01，进行GO富集分析和KEGG通路分析，进一步阐释金莲花有效活性成分治疗炎症的分子机制，最后通过微生信平台（http://www. bioinformatics.com.cn/）进行绘图。
2.2.5 成分–靶点–通路网络的构建 运用Cytoscape 3.9.1软件，以节点（node）代表活性成分、交集靶点和富集通路，边（edge）代表它们之间的联系，构建有效活性成分–炎症靶点–通路网络图，并利用软件的Network Analyzer工具计算网络拓扑特征来筛选发挥抗炎作用的核心化学成分。
2.2.6 分子对接验证 根据degree值大小，选择PPI中排名前6位的核心作用靶点与连接交集靶点数目最多的前6种活性成分依次进行分子对接验证。采用PDB数据库（http://www.rcsb.org/）下载核心靶点蛋白3D结构的PDB格式文件，利用PyMOL软件删除水分子和小分子配体，并通过AutoDock Tools 1.5.7软件对蛋白分子补加氢，最后保存为pdbqt格式。在PubChem数据库中下载活性成分3D结构的SDF格式文件，并用OpenBabel 2.4.1软件将其转化为Mol2格式文件，将其导入AutoDock Tools 1.5.7软件，添加原子电荷，分配原子类型，默认所有柔性键可旋转，并保存为pdbqt格式。将活性成分与靶点蛋白进行分子对接，并通过PyMOL软件对分子对接结果进行可视化分析。
3 结果
3.1 金莲花主要成分分析与鉴定
应用UHPLC-Q-TOF-MS技术，得到正离子模式下金莲花提取物总离子流图（TIC），见图1。通过二级碎片离子信息、部分对照品质谱裂解规律、基于MassBank数据库（https://massbank.eu/Mass Bank/）推测及相关文献报道比对等方法进行鉴定、推断，共表征38个化合物，包括黄酮类23个，有机酸类10个，香豆素类1个，单糖2个以及苯乙素类2个，各化学成分具体信息见表1。
3.2 金莲花网络药理学分析
3.2.1 金莲花活性成分筛选及作用靶点预测 根据Swiss ADME平台设定的药动学筛选方法，筛选出17个活性成分（标注于表1），结合相关文献报道[16-19]将不符合筛选标准但药效作用确切的荭草苷、牡荆苷、荭草素-2ʹʹ-O-β-L-半乳糖苷、金丝桃苷、异当药黄素和金莲花碱6个金莲花成分对其进行补充，故而共获得23个金莲花潜在活性成分。通过Swiss Target Prediction数据库预测23个活性成分的作用靶点，在Uniprot数据库校正成标准基因名称，经去重汇总后共得到302个潜在作用靶点。
3.2.2 金莲花治疗炎症潜在靶点分析 根据2.2.2项下方法筛选炎症相关靶点813个，再将预测靶点与疾病靶点基因映射以绘制Venn图，得到交集靶点87个，即金莲花抗炎作用的潜在靶点，见图2。
3.2.3 PPI网络及核心靶点 通过Venn分析获得的87个重叠靶点上传到STRING数据库，进行蛋白互作网络的构建，隐藏游离靶点，最终得到85个靶蛋白节点，864条边的PPI网络模型。同时，保存TSV格式文件，将其导入到Cytoscape 3.9.1软件中进行可视化分析，用degree作为参数计算PPI网络的拓扑特征，筛选出大于degree值2倍中位数的核心靶点13个，见图3。将degree值从小到大排序，排在前6位的核心靶点分别为肿瘤坏死因子（TNF）、蛋白激酶B1（Akt1）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、表皮生长因子受体（EGFR）、酪氨酸蛋白激酶（SRC），表明这些靶点对金莲花抗炎有着重要意义。
3.2.4 GO功能和KEGG通路富集分析 利用Metascape数据库对金莲花抗炎作用靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并对结果进行可视化处理。GO功能富集分析显示共得到1 454个GO生物功能条目，其中与生物过程（BP）相关的条目最多，为1 277条，主要涉及机体外部刺激反应、MAP激酶活性、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联激活、转移酶活性、蛋白质磷酸化的正向调节、炎症反应的调节等生物过程；与细胞组分（CC）相关的条目有74条，主要包括细胞基膜、分泌颗粒腔、膜微区、囊泡腔、细胞外基质、膜筏等；与分子功能（MF）相关的条目有103条，主要涉及芳香化酶活性、丝氨酸水解酶活性、丝氨酸型内肽酶活性、蛋白激酶活性、氧化还原酶活性、单加氧酶活性等。根据P值，分别选取BP、CC、MF富集基因靠前条目绘制条形图，结果见图4所示。KEGG通路富集分析结果显示，共获得155条金莲花抗炎信号通路，主要是癌症中的途径（pathways in cancer）、血脂与动脉粥样硬化（lipid and atherosclerosis）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-17（IL-17）、MAPK、晚期糖基化终末产物-糖基化终末产物受体（AGE-RAGE）、缺氧诱导因子-1（HIF-1）等信号通路。通过P值且富集基因数目较多的条件对上述通路进行筛选，选取排名靠前的20条通路绘制了气泡图，见图5。
3.2.5 成分–靶点–通路网络 将金莲花抗炎活性成分与排名前20条信号通路及其富集靶点基因相关联，运用Cytoscape 3.9.1软件，构建“活性成分–炎症靶点–富集通路”网络图，见图6。该网络包括124个节点（活性成分节点17个、炎症靶点节点87个、通路节点20个），543条边。根据网络拓扑参数degree值进行排序，筛选出排名前6位的活性成分，分别为鼠尾草素（salvigenin）、蓟黄素（cirsimaritin）、香叶木素（diosmetin）、阿魏酸（ferulic acid）、槲皮素（quercetin）和芹菜素（apigenin），表明这些成分在抗炎过程中起关键作用。
3.2.6 分子对接验证 将PPI中排名前6位的核心作用靶点与“成分–靶点–通路”网络中degree值排名前6位的活性成分采用AutoDock Tools 1.5.7软件依次进行分子对接验证，结果见表2。一般结合能小于−5.0 kcal/mol（1 cal＝4.2 J）时表示分子与靶点具有较好的结合活性[20]。分子对接结果显示，香叶木素和TNF（PDBID：2AZ5）、SRC（PDBID：1O43），鼠尾草素和VEGFA（PDBID：4KZN），蓟黄素和Akt1（PDBID：3CQW），芹菜素和PTGS2（PDBID：5F19）、EGFR（PDBID：5UG9）具有较高结合活性，表明上述成分作用于这些靶点可能是金莲花发挥抗炎作用的潜在机制，采用PyMOL软件进行可视化分析，见图7。可视化结果显示，活性成分主要在谷氨酰胺（GLN）、天冬酰胺（ASN）、苏氨酸（THR）、赖氨酸（LYS）、谷氨酸（GLU）、甘氨酸（GLY）、酪氨酸（TYR）、天冬氨酸（ASP）、半胱氨酸（CYS）9个亲水氨基酸残基结合位点形成氢键，与缬氨酸（VAL）、蛋氨酸（MET）、亮氨酸（LEU）、丙氨酸（ALA）4个疏水氨基酸形成疏水作用，其中香叶木素分别在TNF蛋白中氨基酸残基谷氨酰胺-125、天冬酰胺-92及SRC蛋白的氨基酸残基赖氨酸-11、苏氨酸-106、谷氨酸-6处形成氢键作用；鼠尾草素与VEGFA蛋白的半胱氨酸-61、半胱氨酸-68、赖氨酸-107形成氢键作用，与亮氨酸-66形成疏水作用；蓟黄素和AKT1蛋白发生氢键相互作用的氨基酸残基结合位点为天冬氨酸-439、谷氨酸-228，发生疏水作用的氨基酸残基结合位点为丙氨酸-230；芹菜素分别与PTGS2蛋白氨基酸残基缬氨酸-538及EGFR蛋白氨基酸残基蛋氨酸-793、亮氨酸-718形成疏水作用，两种蛋白中其他亲水氨基酸残基如天冬酰胺-375、甘氨酸-225、甘氨酸-536、酪氨酸-373及谷氨酰胺-791、赖氨酸-745、苏氨酸-854均可与芹菜素形成氢键作用。
4 讨论
本研究通过UHPLC-Q-TOF-MS技术联合网络药理学的方法筛选出金莲花有效活性成分23个，抗炎相应靶点基因302个，将其与疾病数据库筛选的813个炎症靶点基因取交集得到87个金莲花抗炎作用的潜在靶点。通过STRING数据库构建87个蛋白靶点的PPI网络，筛选出TNF、Akt1、VEGFA、PTGS2、EGFR、SRC等核心靶点13个。相关研究表明，TNF蛋白表达水平与炎症反应显著相关[21]；Akt1作为Janus激酶（JAK）/信号传导与转录激活因子3（STAT）信号通路的重要组成基因之一，其表达量降低可干预炎症反应的发生[22]。PTGS2蛋白参与多条炎症反应信号通路，实验发现抑制该蛋白表达能够减少炎症介质的产生[23]。
KEGG通路富集分析表明，金莲花抗炎作用靶点主要富集在pathways in cancer、lipid and atherosclerosis、PI3K/Akt、TNF、MAPK、IL-17、AGE-RAGE、HIF-1等信号通路，这里探讨了与炎症关系密切的4条信号通路。PI3K/Akt信号通路在炎症反应过程中扮演重要角色，研究发现降低该通路活化程度，可以使IL-6，白细胞介素-1β（IL-1β），白细胞介素-10（IL-10）等炎症因子的表达水平降低从而发挥抗炎作用[24]；TNF信号通路激活后产生的炎症因子TNF-α能够调控核因子-κB（NF-κB）信号通路，促使相关蛋白的表达来加剧炎症损伤[25]。MAPK信号通路是经典的炎症反应通路之一，其激活时会立即产生大量的炎性介质来干预炎症进程，因此抑制该通路的激活可以有效减轻炎症反应[26]。AGE-RAGE信号通路激活后可以提高NF-κB转录因子的表达水平，从而促进下游炎症因子的产生来加重炎症的发展[27]。由此可见，多条信号通路可能通过协同的方式参与炎症发展进程。
成分–靶点–通路网络分析筛选得到金莲花治疗炎症相关的活性成分，主要为黄酮类和酚酸类化合物，包括鼠尾草素、蓟黄素、香叶木素、阿魏酸、槲皮素和芹菜素等。有研究表明，蓟黄素可以降低经脂多糖刺激的RAW264.7细胞释放NO、活性氧（ROS）、TNF-α、IL-6、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和前列腺素E2（PGE2）等炎性因子，明显下调TNF-α、IL-6和NO蛋白的表达水平[28]；香叶木素具有显著抗炎活性，其机制可能是通过抑制NF-κB通路活化水平，减少炎症因子释放来达到抗炎的目的[29]。阿魏酸能够有效改善溃疡性结肠炎，其作用机制可能与硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP）/NOD样蛋白3（NLRP3）通路调控半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）、TXNIP、NLRP3等，降低IL-1β、IL-6等炎性因子的浓度以及改善细胞形态、活力有关[30]。槲皮素在植物中存在广泛，具有抗炎、抗氧化应激、抗癌等多种药理活性，药用潜力巨大，研究发现槲皮素可以调控MAPK/TLR4信号通路的激活程度，减少炎性介质的释放，来减轻炎症反应[31]。芹菜素临床疗效明确，对动脉粥样硬化、炎性肠病等心血管及神经系统疾病在内的慢性炎症疾病的治疗具有重大意义，其作用机制是抑制NF-κB通路被激活，下调促炎因子的转录[32]。基于此，本研究将金莲花活性成分与核心靶点进行分子对接，结果显示，阿魏酸与靶点蛋白对接活性较低，其余成分与靶点均具有较好的结合活性。由此可见，金莲花活性成分进入机体后可能以多成分的形式协同作用于多个蛋白靶点及多条信号通路来发挥抗炎的作用。
综述所述，金莲花可能通过鼠尾草素、蓟黄素、香叶木素、阿魏酸、槲皮素和芹菜素等核心化合物，作用于TNF、AKT1、VEGFA、PTGS2、EGFR、SRC等核心靶点，调控pathways in cancer、lipid and atherosclerosis、PI3K/Akt、TNF、IL-17、MAPK、AGE-RAGE、HIF-1等信号通路，干预机体外部刺激反应、MAPK级联激活、蛋白质磷酸化的正向调节、炎症反应的调节等生物过程，发挥抗炎作用。该结论为金莲花抗炎的药效物质基础及作用机制进一步研究提供科学的理论基础。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：蔡红业，吴谨，徐林忠．基于UHPLC-Q-TOF-MS技术和网络药理学的金莲花抗炎药效物质基础及作用机制研究 [J]. 现代药物与临床, 2023, 38(5): 1041-1050 .
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