原文题目：Single-cell analysis of gastric signet ring cell carcinoma reveals cytological and immune microenvironment features
通讯作者：Jie Chai
隶属单位：山东第一医科大学和山东省医学科学院山东省肿瘤医院和研究所消化内外科
DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-023-38426-4
胃癌（GC）是全球常见的癌症，发病率排名第五，死亡率排名第四。中国诊断出的早期GC患者少于其他国家，晚期GC患者在诊断时大肿瘤患者中的比例最高。尽管在早期诊断和治疗方面取得了进展，但目前对GC生物学的认识仍处于初步阶段，晚期GC患者的5年生存率仍低于5%。
胃腺癌（GA）是GC最常见的亚型，占所有GC病例的95%。GA 是一种高度异质性疾病，并根据Lauren分类系统分为不同的组织学亚型，包括肠型、弥漫型和混合型。胃印戒细胞癌 （GSRC） 被归类为弥漫型 GA，由粘结性差的细胞发展而来，没有腺体形成。根据世界卫生组织 （WHO） 的指南，GSRC 的组织学诊断基于微观特征，特别是超过 50% 的癌细胞中存在印戒细胞。癌细胞分泌大量的粘液，但大部分不会从细胞中排出。相反，细胞质中的大量粘液将细胞核挤压到一侧，使癌细胞看起来像印戒，因此得名印戒细胞癌（SRCC）。GSRC具有分化低、恶性肿瘤高、侵袭性强、转移风险高、放化疗反应差等特点，发病率逐年上升，尤其是女性。
在这项工作中，依靠scRNA-seq，准确识别SRCC细胞非常重要。从SRCC的独特特性开始，即细胞中含有大量的粘液。采用胃窦基底腺黏液细胞（MUC6和TFF2）和胃窦粘液细胞（MUC5AC和TFF1）的标记基因进行免疫荧光检查，并证实在粘液细胞中鉴定出SRCC细胞。进一步表征，主要取决于组织来源，结合综合验证，如癌症相关评分、InferCNV、CNV 评分和 GSVA，鉴定出 SRCC 细胞。SRCC细胞的变异程度和CNV评分均低于黏液细胞和M/PDA细胞。一般来说，肿瘤细胞容易发生CNV突变，与正常细胞相比，发生CNV变化区域的基因总是过表达或下调。InferCNV估计了单细胞CNV谱图，以区分肿瘤细胞和正常上皮细胞，这与肿瘤的恶性肿瘤无关。第15簇的CNV评分低于黏液细胞簇，这可能对SRCC细胞簇的CNV总分产生影响。肿瘤异质性的作用值得注意。根据上述结果，CNV水平不区分良性和恶性GA细胞，这与另一项单细胞分析的结果一致，其中只有25。0%的静态恶性细胞在GC中表现出高水平的CNV。综上所述，InferCNV和CNV评分为上皮细胞的重组提供了有利的支持。
此外，热图分析显示，SRCC子簇之间也存在显著的异质性。与其他恶性肿瘤类似，肿瘤异质性主要对患者的生存和预后有明显影响，这可能证明 GSRC 患者的预后不良是合理的。在4个亚簇中，进一步分析表明，亚簇中也存在一些高表达基因，如CLDN18、PHLDA2、ATF3、HBEGF、SYTL2、PGC和LYZ。例如，CLDN18-ARHGAP26的重要性得到了证实，因为它在GSRC中频繁融合以响应化疗。CLDN18。2的高表达被认为对晚期GSRC患者的靶向治疗具有潜在价值; CLDN18。2表达和遗传异常分析为晚期GSRC提供了新的治疗选择。然而，在GSRC的研究中尚未报道其他基因，这一领域值得进一步深入研究。
在研究GSRC的过程中，发现MSMB在SRCC细胞中高表达，但在M/PDA细胞中无/低表达，与以前的研究一致。结合相关研究的数据，我们的研究结果表明，SRCC可能起源于胃腺增殖区的MUC5AC-/低MUC6-预坑细胞2;胃小凹上皮的 SRCC 对 MUC1、MUC5AC 和 MUC6 呈阳性，源自胃小凹上皮的 SRCC 可能起源于胃坑和腺颈底部的增殖区域。IHC结果证实了胃中央凹增殖区的MSMB表达水平。MSMB的UMAP图还表明，子集群7和8相邻并且密切相关。因此，在子簇7中检测到较高的MSMB表达水平，而子簇0，2，3，5，10和17来自其他部位的粘液细胞。SRCC 可能源自子集群 7。因此，MSMB是GSRC的潜在标志物，可能与GSRC的分化和发展有关，其特定的生物学功能值得进一步研究。
GC的异质性主要由肿瘤实质决定，并与其肿瘤微环境（TME）密切相关。为了阐明M/PDA和GSRC之间生物学行为的显着差异，分析了肿瘤实质和TME。
通过上调差异表达基因（DEGs）的富集分析发现，与M/PDA细胞相比，SRCC细胞富集异常活跃的癌症相关信号通路（癌症转录失调、癌症通路和癌症microRNA），这可能与GSRC预后相对较差和对化疗不敏感密切相关。DEGs还与免疫应答的信号通路（TNF-α信号通路、TGF-β信号通路和NF-kB信号通路）密切相关，恶性肿瘤免疫应答信号通路的活性主要表明肿瘤具有较高的免疫逃逸功能。上述途径富集分析结果与本研究中SRCC细胞系和腺癌细胞系的途径富集分析结果高度吻合。进一步分析表明，M/PDA细胞具有更强的增殖和免疫监视能力，而SRCC细胞具有较弱的细胞粘附和较强的免疫逃避能力。GSRC细胞由于增殖低，对化疗的敏感性低于M/PDA细胞。研究表明，细胞粘附的变化在GSRC的发生和发展中起着重要作用。由CDH1基因编码的E-钙粘蛋白是一种细胞粘附分子，参与GSRC的早期形成并起着至关重要的作用。GSRC中细胞粘附相关基因突变的频率增加3。PPI网络分析显示107个与细胞粘附相关的突变基因，表明细胞粘附途径在GSRC肿瘤发生中起重要作用。然而，揭示了M/PDA和SRCC细胞之间的CDH1表达水平基本相同，这可能与GSRC在形成早期未被检测到有关。与M/PDA细胞相比，SRCC细胞的细胞间粘附功能降低;然而，细胞间粘附功能降低或破坏，这是导致癌细胞脱离亲本肿瘤引发转移的关键，也可能与侵袭性生长和转移的风险较高有关，特别是对于植入式GSRC转移。
M/PDA的细胞信号通路富集在缺氧诱导因子1（HIF-1）、P53和PI3K-AKT信号通路中，这与先前报道的发现一致。SRCC细胞也可能在MAPK信号通路中显着富集，该通路参与肿瘤生长，增殖和转移。这可能是GSRC高水平侵袭和转移的内在原因之一。此外，发现雌激素信号通路也可能在SRCC细胞中被异常激活，证实了雌激素在GSRC的发生和发展中可以发挥重要作用。先前的研究表明，年轻女性GA患者易患GSRC，超过80%的GSRC细胞可分泌粘蛋白并表达雌激素受体，更容易转移到卵巢，说明GSRC对雌激素具有较高的亲和力，可促进肿瘤生长和侵袭。雌激素和MAPK信号通路可以通过膜引发的类固醇信号传导相互作用和促进。雌激素信号传导也可以由核启动的类固醇信号激活，并且可以由HPS70、HPS90和FKBP5调节。在这项研究中，热休克蛋白家族成员在雌激素信号通路中显着富集。有人指出，核启动的雌激素信号传导是其在GSRC中发挥作用的重要途径之一。总的来说，这些发现表明，阻断MAPK和雌激素信号通路是治疗GSRC的潜在方法，应进一步探索相关的特定内部机制。
肿瘤组织不仅由肿瘤细胞本身组成，还由TME中的细胞组成，例如免疫细胞，成纤维细胞，血管内皮细胞和基质细胞。在这些细胞中，肿瘤浸润免疫细胞（TIC）在肿瘤发生、发育和治疗中起着至关重要的作用。因此，对GC中TICs进行定量分析，特别是对M/PDA和GSRC免疫微环境的比较分析，可以阐明GC发生发展中免疫应答机制的特点，从而为免疫治疗奠定理论基础。
GSRC中B细胞亚簇具有独特的浸润特征，以滤泡B细胞的浸润为主，其主要功能是激活免疫系统过程和调节B细胞。它们在免疫应答中的表现相对较弱，表明免疫微环境相对受到抑制，并且从功能聚类分析和准序贯分析中获得了相同的结果。滤泡B细胞约占细胞总数的25%，这表明B细胞在GA抗肿瘤免疫中的重要性，并提示GSRC预后不良的原因之一。
CD4-Treg细胞在癌组织中的浸润率显著高于癌旁组织，尤其是GSRC。此外，GSRC中浸润的FOXP3+ CD4-Treg细胞多于M/PDA，CD8-Teff细胞在癌组织中的浸润比例低于癌旁组织，特别是在GSRC中。目前的研究表明，Treg细胞可以抑制效应T淋巴细胞的功能，FOXP3的阳性表达是其主要特征。FOXP3+ CD4-Treg细胞的阳性率越高，GC的进展越快，存活率越低。这也可能是GSRC预后不良的原因之一。
综上所述，GSRC中B细胞和T细胞的亚簇具有独特的浸润特征。在GSRC中，滤泡B和CD4-Treg细胞的浸润增加，CD8-Teff细胞的浸润减少。因此，GSRC具有免疫抑制的微环境，这可能与免疫治疗预后相对较差、疗效较差密切相关。令人遗憾的是，需要进一步研究其基本机制。
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