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题目：Structural basis of NINJ1-mediated plasma membrane rupture in cell death
期刊：Nature
IF：69.504
发表时间：2023年5月17日
通讯作者单位：巴塞尔大学
DOI：https://doi.org/10.1038/s41586-023-05991-z
主要内容：
蛋白质NINJ1驱动与某些类型的细胞死亡有关的膜破裂。对NINJ1的调查揭示了其功能的机制细节，提高了开发新疗法的可能性。
程序性细胞死亡（PCD）是在癌症和发育过程中清除受损或不需要的细胞的一个核心过程。它在免疫系统的正常运作中也有关键作用。在免疫系统防御领域，PCD可以使细菌或病毒失去其宿主细胞，从而阻止感染的传播。对死亡的控制在生命中是如此重要，以至于至少有三种复杂的PCD途径--称为细胞凋亡、热凋亡和坏死--已经进化出来。Degen等人和Kayagaki等人在《自然》杂志上撰文，阐明了蛋白质NINJ1是如何在某些类型的PCD的最后阶段发挥作用的。
长期以来，PCD和基因编码死亡背后的机制一直吸引着生物学家。研究最多的PCD形式，最初是由Karl Vogt在1842年观察和报告的，现在被称为细胞凋亡，通常以垂死的细胞萎缩和碎裂来 "安静 "地结束，然后被巨噬细胞吞噬，巨噬细胞负责处理这些垃圾。相比之下，热死病和坏死病都是以一声巨响结束的--包围细胞并对细胞完整性至关重要的质膜破裂，细胞内容物漏出。在某些情况下，凋亡细胞可以发展到第二阶段（称为凋亡的二次坏死），在这个阶段，垂死的细胞形成 "气泡 "状结构，质膜最终破裂。
如果细胞以这种方式破裂，其细胞质内容物溢出，通常包含在细胞质中的蛋白质，如乳酸脱氢酶（LDH）和大型促炎症分子，称为损伤相关分子模式（DAMPs），会从细胞中逃逸出来（图1）。细胞外DAMPs的存在向免疫系统表明一切都不太妙，并形成持续的、有时是极其强烈的炎症反应来对抗威胁。裂解、坏死和细胞凋亡中的浆膜破裂都可以在应对病毒或细菌感染时被触发，而且都是许多慢性病（包括癌症和神经退行性疾病）中组织损伤的基础。
热化作用的核心是形成孔隙的蛋白GSDMD。它通常以可溶形式存在于细胞质中，但当在热化过程中被激活时，它就会在质膜上聚集形成孔隙。这些孔是相当小的（直径约21纳米）--大到足以让促炎症分子逃离垂死的细胞，但太小了，无法允许释放大的DAMPs和LDH。长期以来，GSDMD孔被认为是通过离子的非选择性流动和渗透压的诱导来促进细胞破裂的被动过程。然而，这一观点被一项研究推翻了，该研究表明，浆膜破裂和热化过程中LDH和DAMPs的释放需要NINJ1。正如该研究和Kayagaki等人的工作所示，NINJ1也需要用于细胞凋亡中的浆膜破裂，这一事件发生在细胞死亡开始后，与GSDMD无关。
NINJ1是一个小的跨膜蛋白，包括一个细胞外的氨基末端区域和两个羧基末端的跨膜螺旋。该蛋白以前被确定为一种粘附分子，在神经损伤后产生。因此，它被确定为细胞死亡中膜破裂的一个关键媒介，是一个重要的、意想不到的发现。
NINJ1在膜破裂中的作用的确切细节和NINJ1功能的分子机制并不完全了解。Degen及其同事解决了这个问题，并通过使用各种成像技术和生物化学方法表明，NINJ1可以进行构象重排，导致该蛋白的多个拷贝的自我结合（低聚物化）。这种结构穿透了膜，形成了不规则形状的大孔。
Kayagaki等人报告了他们开发的一种名为克隆D1的强效抗NINJ1抗体，它能阻断NINJ1的寡聚，防止细胞在热凋亡和凋亡的情况下破裂。通过细胞研究和检查与肝炎有关的细胞死亡的小鼠模型，Kayagaki及其同事表明，无论是编码NINJ1的基因缺失，还是由克隆D1介导的NINJ1抑制，与具有功能性NINJ1的细胞的情况相比，减少了浆膜破裂，降低了LDH和DAMPs的释放。
Degen等人使用交联技术揭示了NINJ1的低聚物化发生在GSDMD孔形成之后，并且LDH的释放发生在NINJ1低聚物形成的时候。生成NINJ1的功能活性荧光形式使作者能够观察到这种蛋白在热化过程中聚集在质膜上。在此基础上，Degen等人使用超分辨率显微镜揭示了NINJ1在膜上聚集成长的、高度分叉的丝状物和大的、环状的结构。值得注意的是，这些细丝中的一些达到了微米级的长度。
Kayagaki和他的同事使用尺寸排除色谱法、活细胞成像和阴性染色电子显微镜的组合，表明NINJ1寡聚成大的细丝，这些结构的组装被克隆D1阻断。最重要的是，克隆D1阻止了NINJ1介导的货物释放，该货物被包裹在脂质中（脂质体），表明该抗体在模型膜系统中具有功能性。
Degen及其同事在体外产生了NINJ1，并使用一种洗涤剂提取了一种低聚物形式，他们使用单粒子低温电子显微镜（cryo-EM）对其进行了分析。获得的结构达到了接近原子级的分辨率，并揭示出NINJ1丝状体的基本重复单元包括四个α螺旋结构（图1）。C端的两个疏水跨膜α螺旋（α3和α4）堆积在一起，形成花丝的核心，而N端区域的两个螺旋中的一个（α2）与α3和α4包在一起。两个螺旋中的第二个螺旋（α1）以独特的角度坐在α2上，并形成广泛的亚单位内接触，将相邻的NINJ1蛋白连接起来。
作者发现，α2、α3和α4的分子排列与使用蛋白质结构预测工具Alphafold9生成的模型一致。相比之下，而且毫不奇怪的是，α1的关键作用以及该螺旋在驱动NINJ1自组装方面的分子相互作用并没有被Alphafold预测出来。这加强了在结构生物学中使用实验方法的必要性，因为预测技术既不能揭示NINJ1的显著功能，也不能揭示这个相对较小的蛋白质的机制复杂性。
Degen等人对NINJ1如何破裂膜提供了一个解释。一个关键的观察是，α1和α2有一个面是疏水的，另一个是亲水的。因此，在NINJ1没有低聚的活细胞中，有人提出α1和α2是在细胞外环境中，而不是在膜上。然而，在细胞死亡过程中，α1和α2插入到膜中，从而主要通过α3和α4以及来自相邻亚单位的α1的疏水面之间的相互作用来驱动NINJ1寡聚。这种结构将破坏膜的完整性，并通过将α1和α2的亲水面引入疏水膜而形成一个病变，或孔隙。Degen等人通过对NINJ1突变体的全面分析和分子模型研究支持了这些机制观点。
Kayagaki及其同事将NINJ1中与克隆D结合的区域映射为NINJ1的C末端--一个低温EM结构中没有捕捉到的灵活区域。以前，N端和C端已被证明（通过突变研究）不是质膜破裂所必需的。作者认为，克隆D1的功能是通过阻断NINJ1蛋白的自我结合来防止NINJ1的寡聚化。
这两项研究揭示了NINJ1如何在PCD的最后行动中发挥作用，确保细胞膜的完全破坏和DAMPs从细胞质中释放。因此，NINJ1加入了一个参与PCD的孔隙形成蛋白的拥挤领域。这些分子在细胞凋亡（如穿孔蛋白）、热凋亡（GSDMD）和坏死（如细菌成孔毒素或蛋白质MLKL）中具有核心和多重作用。
许多问题仍然存在。例如，如何整合和控制不同类型的PCD以实现DAMPs的最佳释放？是什么精确地触发了NINJ1诱导的孔的形成？最后，能够在体内抑制NINJ1的孔隙形成活动的抗体的鉴定，提出了NINJ1是否可能代表某些慢性炎症性疾病的治疗目标这一令人感兴趣的问题。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-023-05991-z
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