以下文章来源于Ad植物微生物 ，作者小黄
2023年5月22日，国际权威学术期Microbiome发表了西北农林科技大学韦革宏（Microbiome | 韦革宏团队揭示简化的合成微生物群落激活植物系统抗性协同保护植物！Microbiome | 西北农林科技大学研究揭示植物驯化塑造小麦根际微生物组组装和代谢功能！）和焦硕教授团队的最新相关研究成果，题为Metagenomics insights into responses of rhizobacteria and their alleviation role in licorice allelopathy的研究论文。
摘要：
化感作用与植物根际生物学过程紧密相连，根际微生物群落对植物的发育十分重要。然而，人们对甘草根际微生物群落受化感物质影响的了解仍不够充分。本研究结合多组学测序和盆栽试验，研究了外源添加化感物质对甘草根际微生物群落的影响，并分析了甘草微生物群落对外源添加化感物质的响应。外源甘草酸能够抑制甘草的发育，并且重塑了根际微生物群落。在外源甘草酸的添加下，甘草根际富集了特定的具有甘草酸降解能力的细菌。富集的根际微生物主要是鞘氨醇菌属(Novosphingobium)，并且在宏基因组中可以组装到鞘氨醇杆属菌株的基因组。进一步研究阐明了单菌和合成菌群对甘草酸的降解能力及其对甘草化感作用的缓解效果；结果表明分离到的菌株N(Novosphingobium resinovorum)对缓解甘草幼苗的化感抑制作用具有较强的效果。外源添加甘草酸能够模拟甘草的化感自毒作用，甘草根际细菌在缓解甘草的化感作用及维持其幼苗的正常生长中发挥了重要作用。本研究的结果能够增强对甘草化感作用中根际细菌群落动态变化的认识，从而为使用根际细菌微生物肥料解决药用植物连作障碍提供一种可行性的方案。
引言：
化感作用是指植物和/或微生物之间的相互作用。植物通过这种形式向环境中释放一类被称作化感物质的化合物，这种化合物会对植物自身生长和发育产生不利影响。通常，化感作用具有自毒性，主要由化感物质驱动，大部分是植物的次级代谢产物，如酚类和萜类化合物。近年来，药材连作种植面积有所增加。在此情况下，连作障碍已成为制约中药农业生产的主要问题，其中化感自毒性是导致中药连作问题的主要因素。
大量研究报道了根际微生物群落与植物生长表现（植物营养、生长、抗病性和非生物胁迫的抵抗能力）密切相关。此外，许多研究表明化感作用是涉及供体和受体植物间化合物识别、信号转导等复杂的生物学过程，但是目前对根际微生物群落与化感物质自毒性之间的联系知之甚少。
多组学测序技术被广泛用于根际微生物群落研究。宏基因组学分箱技术的发展也使得从复杂环境中获取单菌基因组信息成为可能。宏基因组测序技术也可被用于获取微生物群落中次生代谢产物合成基因的多样性。甘草是一种多年生草本豆科植物，它具有抗肿瘤作用并具有抗氧化性能。高需求和低供应导致了甘草的连续种植，筛选具有降解化感物质能力的微生物有助于缓解甘草连作问题，提高甘草产量和土地可持续利用。
本研究结合组学分析和盆栽接种试验进行了以下研究：
（1）外源化感物质添加对甘草表型和土壤性质的影响以及根际细菌多样性和功能的变化；（2）阐明根际细菌添加对甘草生长的影响。
据此推断：
（1）特定的根际细菌能够在外源化感物质添加后被富集；
（2）这些富集的菌株具有潜在的降解外源化感物质的能力，从而缓解甘草化感作用带来的生长抑制。
结论：
1、化感物质对甘草生长特性和土壤性质的影响
外源化感物质(甘草酸)对植株的生长特性有明显的影响(图1a)。在取样后期，水处理鲜叶叶绿素含量显著(P < 0.05)高于化感处理。枝重和根重的变化趋势相似，在中后期水处理高于化感物质处理。此外，从植株发育初期到中期和末期，各生长指标均随植株发育逐渐增加(图1b)。同时，qRT-PCR数据显示，化感作用抑制了甘草酸合成相关基因(HMGR、β-AS、CYP88D6)的表达水平，提高了中后期羽扇豆醇合成相关基因(LUS)的表达水平。末期外源添加甘草酸促进了CYP72A154和CHS的表达水平(图1c)。综上，外源甘草酸在一定程度上抑制甘草的发育。
图1 外源甘草酸添加下甘草植株生长表型及主要次生代谢物合成基因的表达谱
A.甘草植株表型；B.甘草植株叶绿素含量，地上和地下部位的鲜重；C.不同处理和采样阶段甘草根主要次生代谢物合成基因的表达。
2、化感物质对根际细菌多样性和功能的影响
外源添加甘草酸改变微生物多样性和群落组成。大部分根际细菌分类单元在化感物质处理的中期和末期共富集。这些标志分类单元主要是鞘氨醇单胞菌科（Sphingomonadaceae）（图2c）,富集程度最高的分类单元是属于鞘氨醇单胞菌科的鞘氨醇菌属（Novosphingobium）（图2d）。
图2 甘草酸添加后根际微生物群落的变化。
A. 不同采样阶段、处理和采样位置微生物群落的主坐标分析；B. 不同处理三个阶段富集和持续性存在物种的Venn图分析。C. 随机森林识别的8个标志细菌科的相对丰度。D. 富集和持续性存在物种的系统发育分析。
宏基因组测序用于进一步探索根际细菌群落的功能变异。与初始阶段相比，化感物质处理后，中期和末期微生物群落的基因显著富集到146和145个代谢通路。此外，在两个差异表达的基因集之间观察到相当大的重叠（图3a）。宏基因组中组装到74个基因组，其中Novosphingobium具有最高的丰度，可能具有降解甘草酸并适应根际环境的能力。
图3 根际微生物群落的宏基因组学分析及四株分离菌株的基因组学分析。
A. 差异基因的Venn图及功能富集分析。B. 分箱组装到的基因组的基因组特征（GC含量与丰度）。C. 四株单菌分离株的泛基因组学分析；D. 菌株E和N的核心基因组及其功能分类。
3、接种菌株的分离与构建
为了探究上述富集组装的根际细菌的功能，我们尝试用特殊的筛选培养基培养富集的根际细菌。分离得到四株菌，分别鉴定为Ensifer sesbaniae (E), Novosphingobium arvoryzae (Na), Novosphingobium resinovorum (N), 和Hydrocarboniphaga effuse (H)。之后通过LC-MS/MS测定了这些微生物降解化感物质的种类和能力。菌株N纯培养添加对化感物质具有最高的降解率（87.94%），其次分别是菌株E, Na和H。不同菌株降解的化合物种类是类似的。全基因组测序发现菌株N、E具有更多外源化合物降解合成基因（图3c、d）。菌株N、E平板拮抗实验未发现拮抗作用，作为合成菌剂，化感物质降解率达到92、95%（表1）。
表1分离菌株的化感物质降解速率
4、不同根际菌株接种后对甘草生长特性的影响
使用盆栽试验研究了不同根际细菌添加对甘草生长的影响。化感物质抑制甘草生长（图4），菌株接种后均促进植株生长，在化感物质处理组中，菌株N接种处理生长最佳，而在纯水处理组中，菌株E接种后对甘草植株生长的提升效果最明显。进一步研究还发现，菌株N、E接种处理中甘草酸合成相关基因表达上调，说明微生物添加能够缓解外源化感物质对甘草酸合成基因表达的抑制作用。
图4 甘草在不同培养物和外源甘草酸添加组合下的生长表型。
I, 初始采样阶段；A, 化感物质处理; W, 纯水处理; C, 对照组（不加微生物）; N, Novosphingobium resinovorum ; E, Ensifer sesbaniae ; S, 合成菌群.上图和下图分别为特定采样阶段的单个植株和植株簇的植物生长情况。
讨论：
植物化感作用对植物、土壤和微生物群落的影响，可用外源添加化感物质的方式进行模拟。本研究中，甘草酸处理后富集的根际细菌大多数属于新鞘磷脂菌属（Novosphingobium），新鞘磷脂菌属细菌的基因组也在宏基因组分析中被组装到。新鞘磷脂菌属细菌被报道具有降解多种环状化合物的能力。本研究中发现甘草酸处理中富集的功能基因与环状化合物降解有一定关联。环状化合物降解功能也存在于富集和分离的根际细菌的附属基因组中。由于甘草酸主要为环状结构，因此我们推论分离的根际细菌能够降解甘草酸。栽培试验证明分离得到的根际细菌能够降解甘草酸从而缓解甘草的化感抑制，属于Novosphingobium resinovorum的菌株N在缓解甘草化感抑制中具有最好的效果，这提示了一种通过运用特定根际细菌操纵化感物质降解从而缓解药用植物连作障碍的方法。该研究也增强了对植物根际微生物群落和植物化感物质相互作用的认识。
转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号
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