Nature Communications | 三种ARGONAUTEs的空间分布调节花药phasiRNA途径

生殖Argonaute蛋白（AGOs）的位点特异性在许多物种中通过转座子元件沉默实现精准种系发育至关重要。MEL1是水稻19个AGO家族成员中的一种生殖细胞特异性AGO。MEL1与带有胞嘧啶的21个核苷酸（nt）phaisRNAs在5′端位置相互作用，这些RNA来源于水稻减数分裂前和减数分裂早期770多个长的非编码RNA（lncRNA），命名为21PHASs。最近的研究表明，24nt siRNAs从绒毡层移动到减数分裂细胞，这意味着通过花药中的small RNA进行非细胞自主调节。由于体细胞花药壁发育影响生殖细胞发育，它们在花药发育中的同步性表明了细胞间相互作用的重要性。通过移动信号进行细胞间通信对于高等植物中细胞命运的确定至关重要。然而，尽管MEL1与21nt C-phaisRNAs的相互作用在水稻早期减数分裂过程中同源染色体之间的配对中起着重要作用，但花药发育中的非细胞自主机制和21nt phaisRNAs的减数分裂功能仍然未知。因此，关注生殖AGOs作为phaisRNAs的相互作用者，可以阐明phaisRNAs在许多物种中雄性器官发育和通过非细胞自主发育系统增强生殖能力中的分子作用。

近日，知名期刊Nature Communications 在线发表了题为“Spatial distribution of three ARGONAUTEs regulates the anther phasiRNA pathway”的研究论文。该研究在水稻花药中鉴定了两种AGO1b和AGO1d，它们与来源于大量长非编码RNA的phasiRNAs相互作用。此外，3D免疫成像和突变分析表明，水稻AGO1b和AGO1d细胞类型通过充当这些PhasiRNA从体细胞层到花药生殖细胞的移动载体，特异性地调节花药发育，揭示了AGO1b/d和MEL1三种AGO在水稻花药阶段RNA途径中的位点特异性调控。

为了阐明AGO1b和AGO1d的生殖作用，研究人员用CRISPR/Cas9系统对AGO1b和AGO1d进行了基因组编辑，获得ago1b-1、ago1d-3突变体，并通过授粉，获得双突变体ago1b-1 ago1d-3，与WT相比，ago1b-1 ago1d-3双突变体表现出严重的不育性。与野生型花药相比，ago1b-1 ago1d-3双突变体的花药更卷曲、更短，大小和形状也更多样。为了区分突变花药的内部结构，研究人员使用3D成像技术发现双突变体表现出正常的花药结构，但花药内部结构异常例如花粉粒在花药室的部分没有填充，一些颗粒被压碎等等，这些突变分析表明，AGO1b/d冗余地调节花药发育，从而影响花药壁发育过程中花粉的排列、填充和发育，这与生殖细胞特异性M E L 1的减数分裂进展功能不同。

使用花药的Wes表明，在0.4–0.9毫米花药发育的六个阶段中，AGO1b和AGO1d从减数分裂早期到减数分裂后期都富集，为了鉴定与AGO1b和AGO1d相互作用的small RNAs，研究人员对减数分裂前到减数分裂后0.4–0.9mm的花药进行了RIP，发现AGO1b和AGO1d主要与具有5′-末端尿嘧啶的21nt小RNA结合（U-phasiRNAs），此外，大多数AGO1b/d-smallRNAs被归类为来源于21PHASs的phasiRNAs，这是花药特异性lncRNA。

接下来，研究人员使用PHASIS程序进行聚类分析，以检测21PHASs的基因组基因座，这是结合到AGO1b/d上的21nt相siRNA的起源，结果表明AGO1b和AGO1d的U-phasiRNAs亚群分离。为了研究花药中的这些AGO1b/d蛋白，我们在减数分裂早期使用整株花药对AGO1b和AGO1d进行了3D多重免疫染色。发现AGO1b和AGO1d均富集于细胞核和表皮细胞膜；在伸长的横隔室内细胞中，AGO1d在细胞核附近的细胞质中更丰富；在中间层的细胞中，AGO1b存在于细胞核中，在中层细胞的细胞质中检测到微弱的AGO1d荧光信号；AGO1b在绒毡层中的定位仅限于细胞核，而AGO1d同时存在于细胞核和细胞质中；此外，AGO1b主要在减数分裂早期的PMCs细胞核中检测到。

研究人员接着对三种AGOs蛋白AGO1b/d和MEL1在花药中的空间和细胞内分布比较，AGO1b和AGO1d在体细胞花药壁细胞和PMCs中都很丰富，而MEL1仅限于生殖细胞、PMCs。

研究人员进行了原位杂交（ISH）来研究AGO1b、AGO1d和MEL1在2–2.5毫米花序花药中的RNA定位， 研究发现AGO1b mRNA在药室内壁和花药壁中层中表达，但很少在绒毡层内层和PMCs中表达，但AGO1b除了定位于绒毡层细胞层外，还富含PMCs。同样，AGO1d定位在PMCs和花药壁中，而AGO1d mRNA在花药壁中特异性表达。AGO1b/d亚家族基因的mRNA和蛋白在花药中的不同定位表明，AGO1b和AGO1d从外层迁移到内层，PMCs作为phasiRNA的载体。

原文链接:

https://www.nature.com/articles/s41467-023-38881-z

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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