导读
野葛和粉葛是药用植物，具有相似的药理作用，但治疗效果不同。本文提出了一种新的方法来研究代谢产物的分布和鉴定，定量是阐明两种葛根不同治疗效果的必要条件。本研究旨在进行空间分辨代谢组学和生物活性分析，通过分布、鉴定、定量和生物活性系统地比较野葛和粉葛的代谢产物差异，以评估其药理特性。我们进行了空气动力辅助解吸电喷雾电离-质谱成像（AFADESI-MSI），以表征野葛和粉葛代谢产物分布的差异；使用液相色谱-质谱法（LC-MS）对差异代谢物进行了进一步的定性和定量分析；通过MTT分析验证了与代谢物差异相关的生物活性。一些代谢物在两种植物中表现出韧皮部和木质部的互补分布，糖、维生素和肌苷水平在粉葛韧皮部较高，但在野葛木质部较高。3´-羟基葛根素水平在粉葛木质部较高，但在野葛的韧皮部较高。代谢物的定性和定量分析显示，共有52种关键的差异代谢物。MTT法检测结果表明，大豆黄酮、大豆苷、葛根素、芒柄花苷、染料木苷、刺芒柄花素、3'-羟基葛根素、3'-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、3'-甲氧基大豆苷对H9c2细胞缺氧/复氧损伤具有保护作用。野葛提取物的保护效果明显优于粉葛提取物。在本研究中，AFADESI-MSI结合LC-MS和生物活性，全面阐明了野葛和粉葛在分布、鉴定、定量和药理特性方面的代谢物差异。这项研究的结果可以为类似中草药的物种鉴定和质量评估提供一种新的策略。
研究热点：
1. AFADESI-MSI能够广泛检测葛根中大量代谢物；
2. 对葛根中代谢产物的异质性空间特征进行了成像；
3. 用AFADESI-MSI和生物活性鉴别两种葛根。
论文ID
原名：Spatially resolved metabolomics combined with bioactivity analyses to evaluate the pharmacological properties of two Radix Puerariae species
译名：空间分辨代谢组学结合生物活性分析评价两种葛根的药理特性
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.195
发表时间：2023.04
通讯作者：黄璐琦&郭娜&赵宇平
通讯作者单位：中国中医科学院
实验结果
1. AFADESI-MSI对葛根中代谢产物的高灵敏度、宽覆盖检测
由于组织的高度异质性，粉葛和野葛可以分为不同的微区，包括周皮、韧皮部和木质部。随着葛根的生长，我们在根的横截面上可以看到一系列韧皮部和木质部交替的同心圆形图案（图1）。我们利用AFADESI-MSI绘制了葛根中代谢物的空间分布图。优化的AFADESI-MSI系统显示出许多初级和次级代谢产物，包括糖类、氨基酸、维生素、胆碱、氮碱、有机酸、酚酸、异黄酮和葛根素。图1显示了粉葛代谢产物的代表性MSI图像。AFADESI-MSI使葛根组织异质性的关键特征得以可视化。例如，valyl phenylalanine、LysoPC（22:6）和肉桂酸主要聚集在粉葛周皮中。木糖、古洛糖、泛酸、抗坏血酸和肌苷在韧皮部中的强度高于其他微区。代谢产物的异质性分布与代谢和功能密切相关。LysoPC（22:6）作为植物中的一种脂质信号分子，在植物胁迫响应中发挥着重要作用，有助于周皮保护植物免受外部环境干扰。韧皮部的主要功能是运输营养物质，这解释了糖和维生素等营养物质的积累。胆碱可以通过直接影响植物的代谢或改变根系环境来影响植物的生长，是影响人体生物膜结构和功能的一个生物因素。周皮和外部韧皮部的胆碱水平较高，外部组织对分布的偏好可能与根环境的改变有关。有机酸和酚酸是葛根次级代谢途径中的小分子，酚酸具有显著的药理活性，如抗肿瘤、抗炎、抗病毒、免疫调节、抗凝血剂和清除自由基的活性。大多数酚酸存在于所有微区，但肉桂酸主要存在于周皮中。异黄酮和puerol是葛根的次生代谢产物。次级代谢产物，如葛根素、3´-羟基葛根素和puerol B，与初级代谢产物相比强度较低，但由于其药用价值或促进人类健康的功能，它们是植物中的重要物质。
AFADESI-MSI有助于检测葛根中的各种化学成分，并可以准确识别这些成分在微区中的分布，这可以用来比较粉葛和野葛之间代谢物空间分布的差异。此外，AFADESI-MSI确定的葛根中初级和次级代谢产物的位置有助于建立微观区域与代谢产物分布之间的关系，为葛根的加工方法、合理使用和质量评价提供依据。
图1 粉葛和野葛的光学图像和粉葛代谢物的代表性MSI图像
2. 粉葛和野葛代谢物的空间分布差异
我们用AFADESI-MSI在正离子和负离子模式下评估了粉葛和野葛关键代谢产物的空间分布。图2和图3以及补充图S1显示了与m/z离子有关的详细光谱和其他信息。为了探索粉葛和野葛的代谢差异，我们为每个葛根切片选择了八个区域，并提取原始离子强度数据来进行监督偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。R2Y和Q2在正模式下分别为0.999和0.995，在负模式下分别是0.999和0992（补充图S2A，B）。我们使用200次置换检验对模型进行了验证（补充图S2C，D）。左边的所有蓝色Q2值都低于右边的原始点，Q2点的蓝色回归线与零以下的垂直轴（左边）相交。PLS-DA评分图显示了这两个物种之间的分离，表明粉葛和野葛之间的代谢产物存在显著差异。
图2显示了粉葛和野葛的代谢产物分布。一些代谢产物在粉葛和野葛中的分布是均匀的。例如，在野葛和粉葛中，valyl phenylalanine、LysoPC（22:6）和肉桂酸在周皮中的区域特异性积累相似。然而，大多数检测到的代谢物在这两个物种中表现出不同的分布模式。在粉葛中，阿魏酸、苹果酸和丙二酸分布在不同的组织中。在野葛中，阿魏酸存在于韧皮部和周皮中，而苹果酸和丙二酸在木质部中含量较高。肌苷和维生素在粉葛韧皮部表现出更强的离子信号，但在野葛木质部表现出更高的强度。单糖、双糖及其衍生物是葛根中的内源性小分子，与糖类和类黄酮苷等化合物的合成密切相关。除了麦芽糖醇和甲酚葡萄糖醛酸外，其他糖类在粉葛的韧皮部中含量更高，但在野葛的木质部中含量更高。补充图S1显示了这些代谢物的强度。除了木糖、glutamylalanine和阿魏酸外，大部分代谢产物在野葛中的含量更高。木糖及其异构体在粉葛中的大量表达为其多糖的大规模合成奠定了物质基础。
图2 粉葛和野葛的代表性代谢物的MSI图像
异黄酮作为次生代谢产物，是葛根中的活性成分，在临床应用中具有多种药理活性。在AFADESI-MSI中，同种类黄酮在两个葛根品种之间的空间分布中表现出多样性（图3B和补充图S1）。葛根素及其衍生物3'-羟基葛根素和3'-甲氧基葛根素具有降血糖、抗氧化等药理作用。与葛根素相比，3'-甲氧基葛根素具有更高的脂溶性，具有更好的抗氧化活性。粉葛的葛根素和3'-羟基葛根素富集于其木质部，而野葛的葛根素分布于其各个微区，并且野葛的3'-羟基葛根素在韧皮部中富集。至于3´-甲氧基葛根素，它也更多地聚集在野葛韧皮部，与3´羟基葛根素的分布一致。我们推测，催化3'-羟基葛根素转化为3'-甲氧基葛根素的关键类黄酮3-O-甲基转移酶也位于韧皮部。然而，3'-甲氧基葛根素在粉葛中几乎没有信号响应。橙皮苷和葛根素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷是其他重要的异黄酮。它们都分布在粉葛的所有组织中，但在野葛的外部木质部中更为丰富。一些异黄酮在两个物种之间没有表现出差异。Ambocin和葛根素芹菜糖苷均存在于粉葛和野葛的所有微区。野葛中大多数类黄酮和类黄酮的水平显著高于粉葛，应使用LC-MS/MS进一步评估，以阐明定量差异。
AFADESI-MSI用于可视化粉葛和野葛的代谢产物分布，以阐明这两种葛根的强度和分布差异。Glutamylalanine和阿魏酸在粉葛中表现出较高的强度，其他代谢产物在野葛中表现出更高的强度，这可能表明野葛具有更高的药用价值。然而，我们应该使用其他技术来定量阐明这两种葛根的含量差异。大多数代谢产物在两种野葛之间表现出空间分布差异。特别是，粉葛和野葛的一些代谢产物在韧皮部和木质部的分布是互补的。换言之，一些代谢产物在粉葛韧皮部和木质部的分布模式与野葛相反。例如，糖类、维生素和肌苷在粉葛韧皮部更丰富，但在野葛木质部更丰富；3′-羟基葛根素在粉葛木质部中更集中，但在野葛韧皮部中更富集。这两个品种之间明显的分布差异显示出新的区别特征，有助于探索这两个物种组织之间的功能差异。
图3 (A)粉葛和野葛中糖类的MSI图像。(B)粉葛和野葛中异黄酮的MSI图像。
3. 粉葛和野葛的关键差异代谢物
为了进一步比较粉葛和野葛的代谢组学差异，我们采用UPLC-Q-TOF/MS研究了粉葛和野葛的代谢物谱。补充材料显示了提取方法的优化、UPLC-Q-TOF/MS的色谱方法以及代谢物的鉴定。我们共鉴定了102种代谢产物（补充表S3），包括黄酮类化合物、异黄酮、葛酚苷、芳族化合物、三萜和香豆素。为了检查两个葛根品种之间的所有代谢组学差异，我们对数据集进行监督PLS-DA。R2Y和Q2分别对应于模型的方差和预测精度。当在这两种ESI模式下进行PLS-DA时（补充图S2E和F），野葛和粉葛的成分显示出明显的清晰分布，并且模型性能优异，在正离子模式下R2Y和Q2分别为0.935和0.673，在负离子模式下分别为0.679和0.457。置换检验（n = 200）来验证模型（补充图S2G和H）。左边的所有蓝色Q2值都低于右边的原始点，这表明模型是可重复的，令人满意。
为了确定需要进一步研究的潜在化学标志物，我们使用学生t检验鉴定了差异丰富的代谢物，还使用Benjamini–Hochberg校正的错误发现率（FDR）显著性标准进行了非参数检验。在显著性水平设置为p值且FDR<0.05的情况下，两个物种之间有52种关键代谢物存在差异。补充表S4显示了相应的p值和FDR。另外我们还生成了热图，以突出样品之间化合物水平的差异。尽管野葛和粉葛表现出相似的化学组成，但大多数代谢产物，特别是异黄酮的含量在野葛中上调，在粉葛中下调（图4）。这52种代谢产物构成了两个物种差异的物质基础，以解释药理活性的差异，这需要进一步的定量分析和生物验证。
图4 热图突出显示了粉葛（绿色）和野葛（红色）之间差异丰富的代谢物。葛根样品显示在横轴上，而不同丰度的化合物显示在纵轴上。
4. 代谢产物的定量分析
根据当前和以前的研究结果，野葛和粉葛具有相似的代谢产物谱，但一些初级和次级代谢产物的含量不同。因此，我们应定量分析野葛和粉葛的代谢产物含量，以阐明这两个物种在应用方面的差异。我们对两种葛根中可溶性糖、淀粉、纤维素、抗性淀粉和总黄酮（TFA）的含量进行了分光光度分析。这些糖类的水平在粉葛中显著较高（补充表S5）。野葛样品中TFA含量较高。结合AFADESI-MSI结果，单糖，如木糖，在粉葛中更丰富，这可能解释了粉葛中糖类水平更高的原因。葛根素、大豆苷等异黄酮在野葛中表现出更高的强度，与野葛表现出更多的TFA一致。
根据AFADESI-MSI数据以及粉葛和野葛的关键差异代谢产物，异黄酮含量存在显著差异。定量比较两种葛根中这些异黄酮的含量，有助于更准确、科学地解释差异，从而建立鉴定的标准指标。我们采用UPLC-MS/MS技术对野葛和粉葛中含量丰富的主要异黄酮进行了分析。补充表S6和其他补充材料显示了UPLC-MS/MS在定量限、检出限、线性、精密度、重复性、稳定性和回收率方面的验证结果。我们对含量最高的十种化合物进行过滤并选择用于进一步的定量分析。这些化合物约占全部已鉴定化合物含量的一半。图5显示了这两个物种的十个主要成分的水平细节。包括染料木黄酮、大豆苷和葛根素在内的黄酮类化合物的含量在野葛中高出5-7倍。3′-羟基葛根素和3′-甲氧基葛根素在两种植物中的含量差异最大，其中野葛的含量是粉葛含量的52倍。从这两种植物中提取的含量变化符合AFADESI-MSI、UPLC-Q-TOF/MS和分光光度法分析的结果。这些异黄酮对健康有益，包括预防或治疗癌症或心血管疾病。野葛中异黄酮含量显著较高，表明野葛是治疗部分患者心血管疾病的更好选择。我们通过生物测定验证了这10种异黄酮的生物活性和野葛较好的药效。
图5 粉葛（绿色）和野葛（蓝色）的十种主要成分的含量。数据以平均值 ± 标准差表示。
5. 生物活性测定验证两种之间的差异
我们通过MTT法验证了两种葛根中关键差异代谢产物的生物活性测定，以建立物质基础与生物活性之间的关系，从而解释其治疗效果的差异。MTT法用于评估这些化合物在体外对H/R诱导的H9c2细胞死亡的保护能力。模型组的细胞存活率低于对照组，这有效地说明Na2S2O4引起心肌细胞凋亡（图6A）。同时，我们用一系列浓度的十种异黄酮进行处理后，结果显示与模型对照组存在差异，表明所有选择的化合物都对H9c2细胞对H/R损伤具有保护作用。25μM大豆黄酮，25 μM大豆苷，50 μM葛根素，50 μM芒柄花苷，25 μM染料木苷，12.5 μM刺芒柄花素，25 μM 3′-羟基葛根素，50 μM 3′-甲氧基葛根素，50 μM 葛根素芹菜糖苷和6.25 μM 3′-甲氧基大豆苷显示了对心肌细胞活力的最佳保护作用 。
图6 （A）十种主要化合物对H/R诱导的H9c2细胞活力的影响。数据以对照样本进行标准化。与对照组相比，***p＜0.001；与模型组相比，#p＜0.05；与模型组相比，##p<0.01；与模型组相比，###p＜0.001。数据表示为平均值±标准差。（B）葛根提取物（200 μgꞏmL−1）对H/R诱导的H9c2细胞活力的影响。数据以对照样本进行标准化。与对照组相比，***p＜0.001；与模型组相比，###p＜0.001；与槲皮素组相比，&&&p＜0.001。
我们使用相同的测定方法来评估两种制备的葛根提取物的保护作用，结果表明H/R暴露显著损害H9c2细胞的增殖（p < 0.01)。槲皮素可预防缺血/再灌注损伤中的心肌细胞损伤。因此，我们选择它作为阳性对照来评估保护作用。我们用野葛提取物和槲皮素预处理显著降低了H/R诱导的损伤的严重程度，两者之间没有显著差异（图6B）。相比之下，当与模型组中用粉葛提取物预处理的细胞相比时，活力没有增加。与槲皮素处理相比，粉葛提取物预处理与存活率显著受损有关。野葛提取物在H9c2细胞中对H/R损伤表现出类似于槲皮素的保护作用（图6B）。然而，与槲皮素处理相比，粉葛提取物的存活率显著受损，这可能解释了野葛中异黄酮类化合物的丰度，这可能是Na2S2O4诱导的心肌细胞缺氧保护活性提高的原因。
结论
总之，我们提出了一种策略，通过将空间分辨代谢组学与生物活性分析相结合来评估野葛和粉葛的药理特性，利用AFADESI-MSI对部分代谢产物的分布进行了表征，结果表明其在葛根中具有组织特异性。一些代谢产物在两个物种之间表现出不同的分布和含量。一些代谢产物在两种植物的韧皮部和木质部表现出互补的分布。糖类、维生素和肌苷在粉葛韧皮部中含量更丰富，但在野葛木质部中含量更多，而3′-羟基葛根素在粉葛的木质部含量更高，但却在野葛的韧皮部中富集，从而提供了新的区别特性。此外，我们通过LC-MS/MS和分光光度分析获得的代谢物的定性和定量结果显示，共有52种关键的差异代谢物。糖在粉葛中更为丰富，而TFA在野葛中更丰富，这与AFADESI-MSI的结果一致。生物学分析表明，包括葛根素和大豆黄酮在内的十种主要异黄酮对H9c2细胞具有抗H/R损伤的保护作用，在MTT分析中，野葛提取物的保护作用明显优于粉葛。本研究从分布、鉴定、定量和生物活性等方面全面评估了两种葛根的代谢产物差异。研究结果促进了两种葛根的鉴别、质量评价和应用，为同类中药材的品种鉴定和质量控制提供了新的策略。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0378874123004142
转自：“如沐风科研”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
