以下文章来源于EngineeringForLife ，作者EFL
生物组织在很宽的长度范围内由不同的层或结构分级构成。这种异质性编码了生物组织不同的物理化学性质，如硬度、拉伸性、多孔性和分子的优先分配。例如，人体皮肤由多层组成，其组成在细胞类型、蛋白质和网络方面各不相同，具有不同的厚度、硬度和生理功能，可以保护人体免受外部真菌或细菌的入侵，并感知机械刺激（图1a）。由此衍生的设计具有不同长度的不同相的异质水凝胶，类似于具有高度复杂性的生物组织，但现有的制造技术仍然具有挑战性，这些技术需要复杂的程序并且通常仅适用于批量规模。
近日，来自香港大学的Ho Cheung Shum团队受到生物学中普遍存在的相分离现象的启发，提出了一种基于水相分离的一步制造法以构建包含具有不同物理化学性质的多个相的双水相凝胶。目前的工作探索了一种简便且通用的方法来制造不同长度尺度的异质水凝胶。该方法通过在交联预溶解的单体之前通过相分离引入不混溶的水域，从而实现异质水凝胶的一步制造，称为双水相（TAP）凝胶（图1c）。
相关研究成果以“Phase-separation facilitated one-step fabrication of multiscale heterogeneous two-aqueous-phase gel”为题于2023年5月16日发表在《Nature Communications》上。
图1 TAP凝胶模仿分层异质生物组织
1. 水凝胶的设计机理和相图
水性双相系统 (ATPS)由不相容的成分聚合物之间的分离相互作用引发的，它被认为是研究生物学问题的简单模型系统。通过界面聚合物络合构建的结构具有内部水环境，因此非常柔软和脆弱，刚度仅为数百帕斯卡，这限制了它们的应用。为了克服这一挑战，将单体交联成聚合物网络的凝胶化过程可以为 ATPS 中预先构建的多尺度结构提供更大、更可控的机械稳定性。
相图可以通过实验和理论方法获得，以描绘相分离将作为两种聚合物浓度的函数发生的状态（图1b）。当聚合物的浓度高于临界浓度时，混合物将沿着连接线相分离成两个不混溶的相：富含聚合物 A 和富含聚合物 B 的相（图 1b）。在平衡状态下，两相具有相等的化学势和渗透压。所有平衡点构成一条双节曲线，将单相状态与两相状态分开。双节曲线会受到许多参数的影响，例如聚合物长度、pH 值和温度。上述实验结果与使用平均场理论的理论分析一致，如，Flory-Huggins 模型，它量化了熵和焓的贡献。通过相图和对相分离的基本了解，ATPS 可以为异质水凝胶的进一步设计做好准备。
2. 宏观尺度的异质TAP凝胶
为了类似于宏观的皮肤样结构，作者构建了多层 TAP 凝胶。首先制备由 PEG 8 K 和 DEX T40 组成的混浊混合物，浓度在两相范围内；接下来，通过将预溶解的单体（丙烯酰胺）与交联剂（N，N'-亚甲基双丙烯酰胺）以一定浓度在紫外线下交联15分钟，具有两个不同凝胶相的 TAP 凝胶可以形成（图 2a）。能量色散X射线(EDX)证实PAM 水凝胶网络在两个凝胶相中均成功形成，其中在两个相中均检测到来自丙烯酰胺的氮元素（图 2i、j）。
此外，EDX 分析显示氮 (N) 元素的含量远低于碳 (C) 和氧 (O)，这与 PEG、DEX 和丙烯酰胺的化学结构一致（图 2i）。两种凝胶之间的界面通过使用异硫氰酸荧光素标记的 DEX (FITC-DEX) 和罗丹明标记的 PEG (Rh-PEG) 的共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 进一步表征（图 2f）,界面处的高倍CLSM图像表明，在富含DEX的相中存在一定量的PEG聚合物，在富含PEG的相中存在一定量的DEX聚合物。使用不同的制造模具可以构建更复杂的 TAP 凝胶形态。例如，蝴蝶 TAP 凝胶可以使用预先设计的模具进行构造，并且可以很容易地调整不同凝胶层的排列（图 2d）。
图2 具有异质性的大尺度TAP凝胶
3. 具有模拟肌腱连接的对比刚度的TAP凝胶
生物组织表现出异质的机械特性，模量范围从几十kPa（例如肺和肌肉）到几MPa（包括肌腱和软骨）（图3f）。目前的TAP凝胶太软无法满足实际应用的足够负载，并且它无法表现出通常在生物组织（例如人造肌腱）中观察到的广泛模量。为了进一步提高TAP凝胶的机械强度，作者改变了组成聚合物和凝胶化条件。为了便于比较，ATPS由上一节中形成的PEG 8K和DEX T40组成，命名为TAP gel 1；随后，作者将海藻酸钠(10wt%)添加到TAPgel1中并将其沉入氯化钙溶液中，形成名为TAP gel 2的双网络水凝胶。但添加海藻酸钠的TAP gel 2 未表现出与通常表现出MPa级模量的生物肌腱相当的机械强度。
接下来，作者选择由聚乙烯醇 (PVA) 和 DEX 组成的替代 ATPS 系统来形成 TAP gel 3，之后将 TAP gel 3 浸入含有 1.5 M 柠檬酸钠的盐浴中4天。因此，PVA 水凝胶变得非常坚硬，机械模量EPVA高达3:0 ± 0:1 MPa，其特征在于拉伸张力（图3e）。此外，实验结果表明，未经过盐析过程的PVA凝胶表现出极低的模量，约为44.7 kPa。TAP gel 3可以承受折叠、扭曲和举起比其自身重量重约200倍的重量（图3c）。DEX凝胶相可以比其原始长度拉伸约8倍，但PVA凝胶相很少可拉伸（图3d）。
图3 具有对比刚度的TAP凝胶可模拟肌腱连接
4. TAP凝胶中增强的界面力学
传统的逐层方法已被广泛用于在宏观尺度上制造具有多层的异质水凝胶（图 4a.i）。在本研究中，作者将传统方法与基于ATPS的一步制造方法进行了比较。与传统的顺序方法相比，基于ATPS的方法更简单、更有效，因为它允许一步制造多层异质水凝胶。例如，多层水凝胶可以在溶液制备和交联的单个步骤中构建，而传统方法需要以逐层方式重复多次类似的过程（图4a）。
此外，作者预计此方法制造的异质水凝胶可能会表现出增强的界面力学。由于交联在两相仍处于液态时均匀发生，因此可以实现不同凝胶相在界面处的更好连接。为了证明这一假设，作者用上述两种不同的方法制备了 TAP gel 1，并比较了它们的力学性能，比较了几个关键参数，包括临界应变λc（断裂前的最大应变）和断裂能Γ（应力-应变曲线下的面积）。与传统方法相比，通过我们的方法制造的异质水凝胶显示出增强的机械性能，其中λc和Γ分别增加了两倍和四倍（图4b，c）。通过传统的逐层方法制备的TAP gel 1总是在界面处开始断裂，而通过该方法制备的水凝胶似乎在随机位置断裂（图4d）。
图4 TAP凝胶的增强界面力学
5. 通过3D打印在TAP凝胶内实现可编程细胞模式
在传统的逐层方法中，以可编程方式在中尺度制造嵌入式异质水凝胶仍然具有挑战性。通过静电相互作用或氢键的界面络合，可以使用ATPS的两个水相将3D结构直接打印到水性基质中。因此，通过引入凝胶化过程将水性结构转化为水凝胶的前瞻性步骤将是必要的，并为异质水凝胶结构提供更大的机械稳定性。
为了证明这一概念，作者首先通过使用DEX水相作为墨水和PEG水相作为基质的3D打印在全水环境中构建复杂的架构（图5a）。印刷过程完成后，通过将基质和墨水同时交联成水凝胶来稳定异质结构（图5a）。作者构建了“HKU”和“点”两种图案作为例子，其中嵌入的DEX凝胶比周围的PEG凝胶显示出更高的透明度。特别是通过控制墨水的流速和喷嘴的打印速度，可以以量身定制的方式进一步调整打印结构的结构和尺寸（图5c）。如果在水合环境中，形成的异质水凝胶可以在数天和数月内保持其形态。
此外，作者还进行了额外的实验以证明TAP凝胶对培养细胞长期存活的生物相容性。结果显示细胞在7天后在DEX凝胶相中具有超过95%的活力（图5d）。上述实验表明，TAP凝胶可以通过3D打印以可编程方式构建，例如可用于通过在不同区域培养细胞来构建复杂的合成组织。
图5 TAP凝胶内的3D打印细胞图案
6. 使用TAP凝胶选择性分配和释放分子
最后，作者还探索了 TAP 凝胶的区室化能力，这可能有助于分子在微观尺度上的异质分布。首先，使用涡流辅助乳化方法将微凝胶嵌入另一个散装水凝胶中（图6a）。将由不同比例的含水PEG和DEX相组成的混浊混合物倒在基材上，并进一步交联成水凝胶薄膜（图6b）。在这种结构下，球形DEX微凝胶随机嵌入块状 PEG 水凝胶的三维空间中，如 CLSM 所表征（图6d）。从DEX（FITC标记）到PEG（Rh标记）的相变也通过液滴内外的荧光信号分布揭示（图6e）。
此外，TAP凝胶可以允许同时释放具有时空控制释放曲线的不同分子（图6c）。通过将PEG和DEX凝胶分别浸入水中，封装的分子逐渐扩散到周围的水中，并通过紫外-可见显微镜监测它们的实时浓度。与DEX凝胶相比，PEG凝胶显示以更快的速度和更高的饱和浓度释放罗丹明（图6h）。除了小分子，大聚合物也可以选择性地从TAP凝胶中释放，例如 FITC-DEX 和 Rh-PEG。
因此，当进一步与可编程技术（如3D打印）结合时，多个分子可以以时空控制的方式在TAP凝胶内释放。TAP凝胶中分子的选择性分配和释放为各种应用提供了一个多功能平台，例如伤口敷料和组织再生。
图6 使用 TAP 凝胶选择性分配和释放分子
综上，本文展示了一种基于相分离的受自然启发的方法来构建不同长度尺度的异质TAP凝胶，在关键特征（例如肌肉-肌腱连接、细胞图案化和分子区室化）方面模仿生物系统。除了简单和高效之外，该制造方法还可以构建复杂的嵌入式结构，而这些结构很难用传统方法构建。此项工作已经证明，TAP凝胶中每个相的物理化学性质，例如刚度、拉伸性和对某些分子的亲和力，可以通过改变聚合物成分和凝胶化条件轻松控制。此外，与通过传统的逐层方法获得的对应物相比，此一步法制备的 TAP 凝胶表现出增强的界面力学，作者将这种增强归因于聚合物网络在界面上的渗透和连接增加。
此外，在模拟生物肌肉肌腱连接的情况下，可以部署软水凝胶和硬水凝胶的组合来设计连接软生物组织和刚性电子设备的桥接材料，对健康监测应用具有理想的亲和力。最后，TAP 凝胶中分子的选择性分配和释放特性可能有利于设计具有可控包封和释放特性的药物载体。这些特性非常适合伤口敷料、愈合和组织工程应用。
文章来源：
https://doi.org/10.1038/s41467-023-38394-9
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