英文原题：Photoswitchable Inhibitors to Optically Control Specific Kinase Activity
供稿人：周南 北京大学
大家好，今天为大家介绍一篇ACS Chemical Biology的文章，标题为“Photoswitchable Inhibitors to Optically Control Specific Kinase Activity”，文章的通讯作者是来自德国柏林洪堡大学的Dorothea Fiedler和Stefan Hecht教授。在这项工作中，作者结合了“光控开关的引入”以及“模拟敏感”两种方法的优点，报告了光可切换的偶氮吡唑靶向源自弓形虫的钙依赖性蛋白激酶 1 (CDPK1)。效果最好的偶氮吡唑显示出良好的光化学性质、热稳定性以及两种光静止状态之间 IC50 值的显着差异。因此，可以通过应用不同波长的光来动态和可逆地控制 CDPK1 激酶反应。偶氮吡唑对 CDPK1 的抑制作用极大地依赖于激酶口袋残基的性质，因为活性口袋氨基酸残基大小的连续增加会同时导致抑制活性的丧失。此外，其中两种“光开关”抑制剂在细胞培养模型中表现出抵抗弓形虫和隐孢子虫感染的活性，使它们成为高时间控制精度下剖析 CDPK1 在感染周期中作用的一个工具补充。总的来说，这项工作融合了模拟敏感方法和光药理学的优点，而不影响抑制效力，因此在未来应用于其他蛋白激酶方面具有很大的前景（图1）。
首先，他们为了防止因结构重大改变而导致的抑制活性丧失，分子设计的重点是将光敏单元直接并入已知的靶向 CDPK1 的 PCA抑制剂支架中。并且，当偶氮苯官能团连接在吡唑核的3’位时，重氮基团的引入不会影响原始的空间结构。因此，E异构体代表活性抑制剂，此时吡唑上的酰胺基团与激酶的铰链区形成两个氢键，而3’位扩大的取代基被插入到相邻的疏水口袋中。而经紫外线照射后，E异构体会转化为相应的 Z 异构体，其扭曲的几何形状会阻止与 ATP 结合位点的结合，使抑制剂丧失抑制活性，恢复激酶活性。相反，若Z异构体重新暴露于可见光下则会恢复其抑制活性，因为无活性的Z异构体会异构化回有效的 E 异构体形式（图2）。
基于这些考虑，作者设计并制备了一系列“光开关”抑制剂。这些化合物可以通过一条简短而通用的合成路线获得。(图3)
接着作者为了去评估重氮基团的引入对“光开关”类似物抑制活性的影响，他们表达并纯化了来自大肠杆菌的CDPK1激酶，并使用基于荧光素酶的测定方法，其中信号降低与 ATP 消耗相关，从而与激酶反应的进展相关。在吡唑核心保留了原始取代模式的重氮化合物 (1A-E) 在此浓度下可以完全抑制激酶反应，而去除了吡唑 5 位氨基官能团的重氮化合物 (2A-E 和 3A-E) 则严重降低了抑制效力。此外，正如预期的那样，化合物 4A-E因为缺少了吡唑核心，因此不抑制 TgCDPK1激酶（图4）。
为了进行更定量的分析，他们也记录了剂量-反应曲线。大多数化合物对 TgCDPK1 表现出不错的抑制活性。化合物 E-1D 表现出最弱的 IC50 值 (1.53 μM)，不被考虑用作进一步分析。虽然化合物 E-1B 和 E-1E 是相对有效的抑制剂， 其IC50 值分别为 149 和 452 nM，但初步光照实验表明它们E 和 Z 异构体之间的酶抑制差异可忽略不计。化合物 E-1A 和 E-1C 被认为是两个最有希望的候选物，它们的IC50 值分别为 69 和 111 nM。此外，与各自的母体抑制剂 NA-PCA 和 6-MeO-NA-PCA 相比，E-1A 和 E-1C 在我们的测定中表现出相似的效力，因而验证了“光开关”抑制剂的初始设计（图5）。
鉴于 E 异构体的抑制潜力，作者在生理条件下对所有化合物进行了表征转换行为和热稳定性的光谱实验。1A-E的光谱数据总结如下（图6）。
此外，用对甲氧基取代会导致消光系数增加，具体来看 E-1A 和 E-1C 的 λmax 红移高达 29 nm，E-1B 和 E-1E 的红移高达 19 nm。一般来说，1A−E 在用 365 nm LED 照射使构象 E → Z 和 530 nm LED 照射使构象Z → E异构化时表现出较好行为。在用紫外光照射后，E-1A 的 π-π* 跃迁强度降低，同时出现一条新的波段，拖尾至 550 nm，对应于 Z-1A 的 n-π* 跃迁。计算两种异构体的消光系数的最大差异提供了关于光谱变化的最佳照射波长（1A 为 352 nm）。因此，通过将 340 nm LED 与 350 nm 带通滤波器结合使用，实现改进1A光静止状态的组成（图7）。
鉴于偶氮吡唑 1A 的理想特性及其在光照射实验中表现出的良好行为，作者接下来研究了 1A 的 E 和 Z 异构体的不同空间占据对 TgCDPK1 的抑制效力的影响。E-1A 用优化波长（340 nm LED 结合 350 nm 带通滤波器）照射 11 分钟，导致 IC50 值从 69 增加到 296 nM。后一个值与计算出的 81% Z 的 PSS 密切相关。剩余 19% 的 E 异构体将导致观察到的 IC50 值增加到 342 nM，强烈表明 Z-1A 对 TgCDPK1 完全无活性。在用 565 nm LED 与 532 nm 边缘通滤光片组合照射后，IC50 回落至 86 nM，从而产生足够的动态范围以通过抑制剂光开关暂时控制激酶活性。 这些观察结果表明，通过用不同波长的光照射对激酶反应进行可逆控制应该是可行的（图8）。
为了实现两种状态的最大抑制差异，作者选择抑制剂浓度300 nM。其中 TgCDPK1 在 565 nm PSS 中被抑制 96%，在 340 nm PSS 中仅被抑制 50%。实际上，通过用 565 nm 光激活 1A 几乎可以完全暂停激酶反应。在 340 nm 光下抑制剂异构化回其 Z 形式后，激酶反应恢复，该法展示了将“光开关”部分引入抑制剂支架后如何能够在多个周期下对激酶活性进行精确的时间和可逆控制（图8）。
TgCDPK1 的甘氨酸残基使其成为大体积 PCA 抑制剂选择性相互作用的极佳目标。来自其他寄生虫的 CDPK1 直系同源物也含有小的氨基酸残基，例如甘氨酸或苏氨酸。基于这些观察，E-1A被研究用于抑制这一系列的同源CDPK1激酶，表明 E-1A 的抑制潜力与口袋氨基酸残基的性质之间存在相关性（图9）。
额外的剂量-反应曲线分析证实了之前的观察结果。含有甘氨酸残基的 CDPK1 直系同源物最有效地被 E-1A 抑制。具有苏氨酸残基的直系同源物（例如 EtCDPK1 和 PfCDPK1）的靶向作用较弱，并且 E-1A 对这些激酶表现出相当高的 IC50 值（图10）。
氨基酸残基大小对 E-1A 抑制的这种影响也通过将 TgCDPK1 的残基依次突变为更大的氨基酸来研究。在这里，通过将残基甘氨酸扩大到丝氨酸、苏氨酸或亮氨酸来减小 ATP 结合口袋的大小，导致抑制剂效力逐步下降，活性位点的空间位阻冲突表现为 IC50 值从 69 nM 上升 (WT) 至 202 nM (G128S)、823 nM (G128T)，最终为 3.70 μM (G128L)。总的来说，E-1A 的有效抑制需要一个大的ATP 结合口袋，证明了将“光开关”抑制剂与 “模拟敏感” 方法相结合的可行性和潜力（图11）。
最后，作者想评估“光开关”抑制剂 E-1A 和 E-1C 是否具有长期体内应用的潜力。重要的是，基于 PCA 的母体抑制剂在相关浓度范围内对哺乳动物细胞没有毒性。为了评估 E-1A 和 E-1C 对 Tg 的效力，作者将人成纤维细胞与表达 β-半乳糖苷酶的 Tg 孵育 72 小时。实验结果表明，与 Z 富集状态相比，1A 在其 E 异构体形式中表现出更高的预防寄生虫增殖的效力，分别显示 0.53 和 1.31 μM 的 EC50 值（图12）。
总之，将“光开关”部分掺入激酶抑制剂支架提供了一个独特的系统。该系统可以通过外部的光刺激选择和可逆地操纵酶活性，而不牺牲抑制剂效力。由于信号通路的动态特性，这种光药理学方法提供了一个强大的工具来破译不同激酶在复杂细胞过程中的作用。
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
