ACS Chem. Biol. | 两步法实现细胞内碳酸酐酶的配体靶向官能化

英文原题：A Versatile Strategy to Manipulate and Probe Native Carbonic Anhydrases In Cellulo Utilizing Two-Step Ligand-Directed Functionalization

供稿人：黄宗煜 北京大学

大家好，本周为大家介绍一篇ACS Chem. Biol.文章，标题为“A Versatile Strategy to Manipulate and Probe Native Carbonic Anhydrases In Cellulo Utilizing Two-Step Ligand-Directed Functionalization”。文章的通讯作者是来自国立台湾大学的王宗兴副教授。

蛋白质在细胞中发挥着多种重要功能，因此，很多蛋白质成为了临床诊断的标志物以及临床治疗的关键靶点。在药物与临床研究领域中，蛋白质的化学标记与修饰一直是一个热点话题。例如，在蛋白质上标记荧光基团能够实现相关蛋白质在细胞中的表达水平以及空间分布的研究，而在蛋白质上标记富集基团能够实现蛋白质的特异性分离与检测，此外，蛋白质的活性可以通过修饰相应抑制剂来可逆调控。

近几十年来，人们开发了多种蛋白质修饰策略，例如将目标蛋白质与多肽标签（SNAP、Halo标签等）融合，通过修饰被融合的标签实现目标蛋白质的化学标记，另外，直接将目标蛋白质与荧光蛋白融合可以实现目标蛋白质的成像和追踪。然而，融合多肽与蛋白质标签需要依赖基因工程，操作较为复杂，且外源序列的引入会影响蛋白质的原始结构与功能。为了实现位点特异的蛋白质官能化，人们通过遗传密码拓展技术在目标蛋白质的特定位点插入非天然氨基酸。尽管非天然氨基酸的插入能够实现蛋白质的精准修饰，且不会影响蛋白质的原始结构与功能，但是遗传密码拓展技术的应用需要更加复杂的基因工程，操作难度大大提高。

直接用活性基团对蛋白质的侧链进行化学修饰能够避免基因工程的使用，降低操作难度，例如使用NHS活性酯修饰蛋白质中的赖氨酸残基，使用马来酰亚胺修饰蛋白质中的半胱氨酸残基等。然而，受到强化学反应活性的影响，蛋白质侧链的修饰只能够在体外环境以及极端pH下进行，并且不具备位点选择性，容易破坏蛋白质的原始结构与功能。为了实现位点选择性的蛋白质侧链修饰，本文的作者采用了配体靶向的蛋白质化学标记技术，将弱活性的标记基团与中等强度的蛋白质配体相连，使蛋白质活性部位附近的氨基酸侧链被修饰（如图1所示）。在此前的研究中，人们通常直接将功能基团（荧光基团与富集基团等）修饰到目标蛋白质上，因此在将标记基团与配体相连的基础上还需要引入功能基团，大大增加了化学合成的难度。在本文中，作者采用了两步法的配体靶向蛋白质官能化技术，先通过配体靶向标记将叠氮基团修饰在蛋白质的活性部位附近，随后通过点击化学反应将功能基团修饰在相应位点，从而在一定程度上降低化学合成的难度。

图1. 两步法的蛋白质配体靶向官能化策略

本文的作者以碳酸酐酶为研究对象，验证了这一蛋白质修饰策略的可行性与灵活性。它们首先采用配体靶向的蛋白质标记技术在碳酸酐酶活性口袋附近修饰叠氮基团，其中，靶向碳酸酐酶的配体在标记反应中会作为离去基团离去（如图1所示）。作者首先尝试在体外条件下对碳酸酐酶进行叠氮标记（如图1所示），质谱结果表明，叠氮基团的标记效率在60%左右。随后，作者采用张力促进的点击化学反应，分别在活细胞中对标记了叠氮基团的碳酸酐酶进行荧光基团以及生物素富集基团的官能化，结果表明，碳酸酐酶在活细胞中具有很高的官能化效率。

随后，作者采用两步法的蛋白质配体靶向官能化策略在碳酸酐酶的活性部位附近修饰了连有偶氮苯基团的抑制剂（如图1所示）。偶氮苯基团在不同波长的光照下能够发生顺反异构（如图2所示），当偶氮苯处于顺式时，受到构型和构象的影响，抑制剂分子无法进入碳酸酐酶的活性口袋。而当偶氮苯处于反式时，抑制剂分子能够进入碳酸酐酶的活性口袋，并抑制其功能。因此，在碳酸酐酶的活性部位附近修饰连接偶氮苯基团的抑制剂分子后，作者能够通过不同波长的光照实现碳酸酐酶功能的可逆调控。图2中的动力学数据表明，利用该策略能够有效调控碳酸酐酶与外源配体间的结合常数。

图2. 在体外条件下可逆调控碳酸酐酶与配体的结合

利用上述策略，作者在体外实现了碳酸酐酶功能的可逆调控，并测试了其催化对硝基苯乙酸乙酯水解的能力。结果表明，在波长365nm的光源照射下，偶氮苯的构型为顺式，碳酸酐酶的活性不受抑制，其活性和天然碳酸酐酶接近。而在波长405nm的光源照射下，偶氮苯的构型为反式，碳酸酐酶的催化活性受到大幅度抑制，其催化对硝基苯乙酸乙酯水解的能力远低于天然的碳酸酐酶。

图3. 在体外条件下可逆调控碳酸酐酶的催化活性

随后，作者利用两步法的蛋白质配体靶向官能化策略将连有偶氮苯的抑制剂分子修饰在了活细胞中的碳酸酐酶上，并通过光照调控活性。当细胞中碳酸酐酶的活性被抑制时，细胞内环境的pH会发生下调，利用pH荧光探针可以监测细胞内环境pH变化。实验结果表明，在波长365nm的光源照射下，偶氮苯的构型为顺式，碳酸酐酶的活性不被抑制，细胞内环境的pH不发生变化。而在波长405nm的光源照射下，偶氮苯的构型为反式，碳酸酐酶的活性被抑制，细胞内环境的pH会发生下调。

图4. 在活细胞中可逆调控碳酸酐酶的催化活性

最后，作者利用两步法的蛋白质配体靶向官能化策略同时在碳酸酐酶上修饰连有偶氮苯基团的抑制剂分子以及荧光基团，在实现碳酸酐酶追踪的同时对其活性进行调控。结果表明，由于修饰在蛋白质上的分子骨架过大，碳酸酐酶活性的调控不如只修饰一个官能团时容易。尽管如此，碳酸酐酶的催化活性依然可以通过不同波长的光源照射来可逆调控。

图5. 利用两步法的蛋白质配体靶向官能化同时在碳酸酐酶上修饰活性调控基团及荧光基团

总而言之，本文的作者通过配体靶向的化学标记技术在碳酸酐酶的活性口袋附近修饰了叠氮基团，并通过点击化学反应在相应位点修饰了不同类型的功能基团，实现碳酸酐酶的成像、富集以及活性调控。这一灵活的两步法蛋白质配体靶向官能化策略不仅降低了化学合成的难度以及成本，还为实现多维度的蛋白质功能研究提供了便捷。

转自：“ACS美国化学会”微信公众号

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