【Mol Plant】合成生物学是未来！仅三个真菌基因实现植物质体外从头合成维生素A原类胡萝卜素

类胡萝卜素是一类由类异戊二烯基本结构的脂溶性天然色素，其具有维生素A原活性、抗氧化、预防心血管疾病、保护视网膜等功效。维生素A缺乏症依然是许多低收入发展中国家的主要健康问题之一，人体不能合成类胡萝卜素，必须通过饮食（主要是植物性食物）来获取，因此探索植物组织类胡萝卜素生物强化以增加作物营养价值具有重要意义。

2023年5月16日，沙特阿卜杜拉国王科技大学（KAUST）Salim Al-Babili教授课题组在Molecular Plant在线发表题为 “Installing the Neurospora carotenoid pathway in plants enables cytosolic formation of provitamin A and its sequestration in lipid droplets” 的研究论文。打破了目前固有的认知：植物的维生素A原类胡萝卜素（如β-胡萝卜素）只能在质体中合成和储存。该研究通过瞬时表达和稳定转化，成功地将真菌的类胡萝卜素代谢路径导入植物质体外，首次实现从植物细胞质甲羟戊酸MVA路径从头合成维生素A原及真菌特异多共轭双键类胡萝卜素，并鉴定到了胞质脂滴是植物细胞质储存类胡萝卜素的重要细胞器。该研究‘’拓宽‘’了类胡萝卜素在植物细胞中的合成和储存场所，为不同植物/组织（特别是油料种子）的类胡萝卜素生物强化的优化改进提供了新的合成生物学策略。

粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）是一种可以合成和积累大量类胡萝卜素的丝状真菌，但其细胞内不存在质体。作者首先通过烟草瞬时表达实验证实了Neurospora AL-3在植物细胞中可以将MVA途径的5个碳原子的IPP和DMAPP催化生成20个碳原子GGPP；Neurospora AL-2是一个双重功能酶，其可以将GGPP转化为40个碳原子的八氢番茄红素，且具有β环化酶活性，将番茄红素和3-4-didehdrolycopene分别转化为β-胡萝卜素和torulene；Neurospora AL-1具有脱氢酶活性，可将八氢番茄红素合成番茄红素和3-4-didehdrolycopene （见上图）。因此，三个真菌酶可以将5个碳原子IPP和DMAPP转化为40个碳原子的维生素A原类胡萝卜素（β-胡萝卜素），而完成这一合成路径需要至少7个植物代谢酶。

该研究发现类胡萝卜素代谢酶AL-1和AL-2在烟草叶片细胞中定位于质体外且部分定位于内质网，且细胞质MVA路径化学抑制剂可以显著降低新合成的类胡萝卜素的含量，进一步证实了真菌基因介导的类胡萝卜素合成是发生在质体外。此外，共表达了MVA路径限速酶tHMGR能够显著提高烟草叶片和柑橘愈伤中新合成的类胡萝卜素的含量，进一步夯实了前面的结论。

除了绿色组织以外，作者还利用富含淀粉的非绿色组织-柑橘愈伤来验证这一新的代谢工程策略的可行性。如下图A所示，整合真菌代谢通路的柑橘愈伤颜色明显变红，特别是共表达MVA限速酶tHMGR之后，颜色变得更深，且总类胡萝卜素含量也大幅提升。

此外，作者通过细胞器分离纯化实验发现工程化的烟草叶片和柑橘愈伤的胞质脂滴呈现橙红色，而野生型的植物组织的脂滴基本无色 （上图B）。进一步对纯化后的胞质脂滴进行高效液相色谱分析，发现对该细胞器中储存了β-胡萝卜素，γ-胡萝卜素，Torulene 等有颜色的维生素A原类胡萝卜素，而这些类胡萝卜素在野生型的胞质脂滴中无法检测到（上图）。共聚焦显微镜也发现Neil Red（脂滴荧光染料）的荧光与类胡萝卜素的自发光重叠。此外，透射电镜观察发现工程化植物细胞含更较大直径的胞质脂滴，且共表达AtSEIPIN1基因增加了较大尺寸脂滴的数量的同时也能够显著地提高细胞质中类胡萝卜素的积累。这些结果表明胞质脂滴是细胞质储存类胡萝卜素的重要细胞器。植物种子是富含胞质脂滴的组织，作者发现在拟南芥中导入了三个真菌基因产生了红色的转基因种子，并显著增加了种子总类胡萝卜素含量（下图），且种子比叶片等其它含脂滴较少的植物组织积累更多的细胞质类胡萝卜素。以上证据也进一步证明胞质脂滴是质体外类胡萝卜素储存的重要场所，且说明富含胞质脂滴的植物组织（如种子）更适合真菌介导的细胞质代谢工程策略。

‘’黄金‘’大米等一些质体代谢工程化植物组织中的类胡萝卜素存在储藏过程中不稳定的问题。该研究发现柑橘愈伤细胞质代谢工程产生的β-胡萝卜素比在质体代谢工程产生β胡萝卜素具有更强的光稳定性，前者在光下甚至含量增加。因此有可能通过真菌介导的质体外代谢工程来提高作物维生素A原的光稳定性。此外，该研究表明导入真菌代谢路径的柑橘愈伤也产生了更多的脱辅基类胡萝卜素代谢物，比如维生素A醛。

总而言之，这项研究首次证实了质体外重构维生素A原代谢路径的策略在不同物种和不同植物组织的可行性，有可能在传统的质体代谢工程的基础上进一步优化作物类胡萝卜素生物强化。未来需要进一步探索与传统代谢工程策略的兼容性、筛选活性更高的酶以及通过操控胞质脂滴来有效增加产量。另外需要进一步证实类胡萝卜素在植物胞质脂滴中的积累是否可以提高其生物可利用性，进而提升作物果蔬营养价值。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.molp.2023.05.003

转自：“iPlants”微信公众号

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