以下文章来源于北京生物结构前沿研究中心 ，作者王彤彤
沿内体网络发生的膜运输在真核细胞中发挥着重要的作用，进入该网络的蛋白可能进入溶酶体被降解，也可能再次循环到细胞表面或与生物合成或自噬相关的细胞器中1。Retromer和Commander等蛋白复合物在货物的转运中发挥重要作用2。其中，Commander调节包括整合素和脂蛋白受体在内的上百种蛋白非Retromer依赖的重摄取以及循环3，其亚基的突变会导致X连锁智力缺陷 (X-linked intellectual disability, XLID) 以及Ritscher-Schinzel综合征 (RSS) 的发生4，后者为一种多系统的发育障碍，主要表现为颌面部畸形、小脑发育不良以及心血管发育受阻等。
Commander由16个亚基组成，这些亚基形能够形成2个亚复合物—CCC复合物和Retriever 复合物。其中，Retriver为VPS26C、VPS35L、VPS29所形成的三聚体，而CCC complex由12个亚基组成，包括含coiled-coil结构域的CCDC22、CCDC93和COMMD (copper metabolism MURR1 domain) 家族成员COMMD1-COMMD10。Commander的第16个亚基为DENND10 (differentially expressed in normal and neoplastic cells-containing protein 10)2 (图1)。
图1. Commander复合物的亚基组成
2023年5月11日，来自布里斯托大学的Peter J. Cullen和来自昆士兰大学的Brett M. Collins共同通讯，在Cell上发表题为Structure of the endosomal Commander complex linked to Ritscher-Schinzel syndrome 的科研论文，解析了含有完整16个亚基的Commander复合物结构。该复合物模型展示了CCDC如何连接COMMD十聚体环和Retriever复合物，并将DENND10通过中央的coiled-coil募集过来。此外，结合蛋白组研究，本文的工作还揭示了XLID和RSS中无义突变对复合物形成的意义。
研究者首先使用了昆虫细胞对人源Retriver复合物进行重组表达，通过亲和纯化和分子筛对复合物进行分离纯化，得到了化学计量比为1:1:1的VPS26C-VPS35L-VPS29三聚体复合物。冷冻电镜解析所得的Retriever复合物模型整体与Retromer相似，其中VPS35L形成延伸的α螺线管结构，通过其N端和C基端分别与VPS26C和VPS29结合 (图2)。VPS35L与Retromer亚基VPS35序列相似性较低，但其结合VPS29和CCC复合物的能力被保留了下来，其与VPS29的主要相互作用是VPS35L的C端α螺线管介导。结合关键互作残基的突变实验，研究者证实了Retriever和CCC复合物的组装是由VPS29结合VPS35L维持的，这两者之间的相互作用在稳定Retriever和CCC组装中发挥关键作用。
图2. Retriever复合物的整体结构
在Retriver复合物中，两种特殊的互作方式对VPS29的结合起到了关键作用：一方面，VPS35L基部延伸出的β-sheet与VPS29相互作用，互作残基的突变会减弱VPS29的结合，但对CCC复合物的结合没有影响；另一方面，VPS29与VPS35L N端 ~40个氨基酸残基相互作用，此处氨基酸残基的突变或者片段的缺失会同时影响VPS29以及CCC复合物的结合 (图3)。在VPS35L的分子内存在两个PL (Pro-Leu) 基序 (26PL27和34PL35) ，能够与VPS29疏水的表面结合，其中L27和L35与分别VPS29的疏水口袋中的V174和L152相互作用，这2个氨基酸残基的突变显著减少了VPS29和CCC复合物的形成。
图3. VPS35L与VPS29之间的相互作用
在VPS35L敲除的HeLa细胞中，VPS26C水平下降，同时，CCC复合物不再结合内质网，a5b1整合素与LAMP1阳性晚期内质网/溶酶体的共定位增加，所有这些表型都被野生型VPS35L所挽救，而VPS26C结合相关的突变VPS35L(R293E) 则无相应的作用 (图4)。因此，VPS26C可能通过与货物接头蛋白SNX17、WASH复合物作用和/或通过其固有的膜结合能力在调节Commander复合物与内体的结合以及功能行使中发挥关键作用。
图4.VPS35L敲除对细胞的影响
为进一步确定CCC复合物的化学计量比和结构，研究者在大肠杆菌中共表达了所有10种人源COMMD蛋白，并设计了四种多肽编码载体，对不同的COMMD进行标记，经亲和纯化和质谱分析，得到了三种均一且稳定的四聚体亚复合物：COMMD1-4-6-、COMMD2-3-4-和COMMD5-7-9-10，分别称为亚复合物A、B和C。在这些亚复合物中，只有亚复合物C的结构被成功解析，该亚复合物由COMMD5-COMMD10和COMMD7-COMMD9两个异源二聚体组成 (图5)。
图5. COMMD亚复合物的形成
COMMD5-COMMD10和COMMD7-COMMD9主要是通过COMMD5和COMMD7 COMM结构域之间的延伸的β-sheet相互作用。此外，4个COMMD的HN和COMM结构域之间的互作也有助于整体组装的特异性，COMMD10的L129和COMMD9的I118在HN和COMM结构域之间的linker上参与形成2个关键的互作位点。在HN和COMM结构域的二聚化界面上，HN会将COMM结构域β1-β2 之间的loop包裹住 (图6)。
图6. 亚复合物C内部的相互作用
为进一步探究CCDC22和CCDC93与COMMD的相互作用在CCC复合物组装中发挥的作用，研究者将10种人源COMMD和CCDC22、CCDC93的基因克隆进了单一biGBac载体中。经蛋白纯化和后续验证，发现所有的12个蛋白均存在于复合物中，并呈现1：1的化学计量比。
在经冷冻电镜解析得到的结构中，该复合物由10种COMMD蛋白质和CCDC22、CCDC93的N端区域组成，经Relion和Cryosparc处理得到的密度图整体分辨率分别为3.1 Å和3.5 Å。COMMD中心局部分辨率较高，而周围区域分辨率较低，相对动态。COMMD的十聚体环状结构由5个异源二聚体 (COMMD1-6)-(COMMD4-8)-(COMMD2-3)-(COMMD10-5)-(COMMD7-9) 按照严格的顺序排列组成。CCDC22和CCDC93的linker与中央的COMMD基环以及周围HN结构域之间存在很多接触，并通过COMMD4的HN结构域直接与COMMD基环发生相互作用。此外，CCDC22的两个PxxR序列与COMMD5和COMMD3的HN结构域分别形成类似的环并与之结合 (图7)，这些linker区域的广泛相互作增强了COMMD基环的稳定。
图7. 十二聚体CCC复合物的整体结构
DENND10虽然作为Commander复合物的亚基之一，但并不是维持Commander复合物稳定性所必须。然而，AlphaFold2d的预测结果提示DENND10可以与CCDC22-CCDC93二聚体中央coiled-coil（CC1和CC2）相互作用，这种相互作用也在后续的细胞实验中得到证实 (图9)。
图8. DENND10与CCDC22-CCDC93之间的相互作用
那么，Retriver复合物和CCC复合物是如何组装形成Commander的呢？研究者发现， CCC复合物和Retriever复合物之间的相互作用是通过VPS35与CCDC22-CCDC93蛋白之间的相互作用介导的。VPS35L和CCDC22致病突变会影响Retriever和CCC复合物的稳定性，其中，CCDC22 (Y557C) 突变直接位于其与VPS35L互作的界面上，对Retriever和CCC复合物的相互作用产生不利影响，此外，VPS35L致病突变A830T、Del906和P787L会破坏VPS35L C端螺旋管结构 (图9)。
图9. 完整Commander复合物结构及相关致病突变
综上，本文所解析的复合物结构为理解Commander复合物的稳定与X连锁精神发育迟缓 (XLID) 和Reubinstein-Tapan syndrome (RSS) 之间的关系提供了分子水平的信息。
原文链接
https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.04.003
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