导读
个性化饮食会改变生物体的内部新陈代谢，进而影响身体的健康；本研究旨在探讨从黑木耳中提取的多糖对正常C57BL/6J小鼠整体代谢和肠道菌群的调节作用。本研究采用代谢组学和微生物组学方法，为进一步开发利用秦巴山区黑木耳资源和以黑木耳多糖（AAP）为主要功能成分的营养食品提供科学依据。基于LC-MS/MS代谢组学结果，我们共发现51种AAP调控的代谢物，主要富集于精氨酸生物合成途径，相关性最高，其次为精氨酸和脯氨酸；甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸；甘油磷脂，以及鞘脂代谢途径。此外，补充AAP显著改变了小鼠肠道菌群的组成。约氏乳杆菌，食窦魏斯氏菌，考氏科萨克氏菌，粪肠球菌，动物双歧杆菌和同形类杆菌的相对丰度水平显著上调，而厚壁菌门细菌M10-2的相对丰度被下调。AAP的生物活性可能与内源性代谢和肠道菌群组成的调节作用有关。
论文ID
原名：Effects of Auricularia auricula Polysaccharides on Gut Microbiota and Metabolic Phenotype in Mice
译名：黑木耳多糖对小鼠肠道菌群及代谢表型的影响
期刊：Foods
IF：5.561
发表时间：2022.09
通讯作者：刘茜
通讯作者单位：西北大学食品科学和工程学院
实验结果
1. AAP对小鼠肠道菌群多样性的影响
如图1A所示，正常饮食（ND）和AAP组的稀释曲线逐渐平滑，表明肠道中的物种并未因测序样本数量的增加而增强，在本研究中足以反映样品的菌群特征。丰度等级曲线直观地反映了物种的丰度和均匀度。膳食补充剂AAP并未破坏小鼠肠道菌群的稳态（图1B）；然而，Chao1、ACE、Shannon或Simpson指数在统计上没有显著差异（图1C-F）。
图1 黑木耳多糖对小鼠肠道菌群α多样性的影响
(A) 稀释曲线；(B)丰度等级曲线；(C) ACE指标的组差箱形图；(D) Chao1指数；(E) Shannon指数；(F) Simpson指数。ND = 正常饮食；AAP = 黑木耳多糖。数据表示为平均值± SD，n = 5。
2. AAP对小鼠肠道菌群β多样性的影响
β多样性主要描述了空间尺度上物种组成的变化，以评估组别之间的相似性；它可以通过PCoA进行分析，可以直观地显示不同处理样品中微生物的异同。如图2A所示，ND组和AAP组的肠道微生物结构相似，表明膳食补充AAP并没有显著改变肠道微生物的β多样性。β多样性组间差异分析的箱形图如图2B所示。ND组和AAP组的中值、最大和最小样本值存在一定差异。
Anosim和MRPP分析用于确定ND和AAP组之间的群落结构是否存在显著差异。Anosim分析是一种非参数检验，用于测量组间差异是否显著大于组内差异，以确定组是否有意义。我们基于Bray-Curtis距离值排序进行组间差异的显著性检验。分析表明，ND组和AAP组之间的R值和p值分别为0.864和0.001，表明它们之间存在显著差异。此外，MRPP是基于Bray-Curtis距离的参数检验。观察到的delta值越小，组内差异越小；预期的delta值越大，组之间的差异就越大。大于零的值表示组间差异大于每个组内的差异。小于零的值表示每组内的差异大于组间的差异。显著性值小于0.05表示显著差异。ND组和AAP组之间的观察delta值、预期delta值和显著性值分别为0.0717、0.2683、0.289 和0.008，表明组间微生物群落结构存在显著差异。
从图2C可以看出，小鼠肠道菌群的相对丰度在摄入AAP后发生了变化。在门水平上，小鼠粪便样本的微生物群落结构主要由拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门、Campilobacter、去铁杆菌门和变形杆菌门组成。其中，厚壁菌门和拟杆菌门是优势菌群，与前人研究结果一致。因此，两组小鼠的肠道菌群相似。与ND组相比，AAP组的拟杆菌门、放线菌门和变形杆菌门的丰度显著增加，而厚壁菌门则显著下降。
图2 黑木耳多糖对小鼠肠道菌群β多样性的影响
(A) 基于加权unifrac距离的主成分分析(PCoA)；(B)组间Anosim差异分析；(C) 基于加权unifrac距离的算术平均(UPGMA)聚类树的未加权对组方法；(D)种水平下经学生t检验后的组物种差异分析图。ND =正常饮食；AAP = 黑木耳多糖。数据表示为平均值± SD，n = 5。
通过组间学生t检验，我们发现具有显著差异(p < 0.05)的菌株，如图2D所示。膳食补充AAP显著增加了约氏乳杆菌、食窦魏斯氏菌、Kosa Cosac Cowanii、粪肠球菌、动物双歧杆菌和同形拟杆菌的表达，同时显著降低厚壁菌门细菌M10-2的丰度。
3. AAP摄入后小鼠血清生物标志物的筛选
质谱共检测到239种物质（负离子模式）和368种物质（正离子模式）。血清生物标志物的筛选策略如下：我们采用多元统计分析方法分析ND组和AAP组两种模式下的血清代谢物谱数据，并采用监督分析方法——偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），用于发现、筛选和鉴定差异代谢物。
两组数据的OPLS-DA分析如图3A、B所示。横坐标t(1)P表示代表第一主成分的预测主成分得分，表示各组之间的差异，纵坐标t(1)O表示正交主成分得分，表示每个样本组内的差异。每个圆点代表一个样本，圆点的形状和颜色代表不同的实验组。从OPLS-DA评分图结果看，ND组和AAP组小鼠血清样本差异显著，所有样本均在95%置信区间内（Hotelling的T方椭圆）。
此外，我们还使用了置换检验来验证模型是否过拟合。如图3C、D所示，横坐标表示随机样本与原始样本之间的相关性，纵坐标表示R2Y和Q2的值。在正离子模式下，ND vs. AAP的R2Y(cum)和Q2(cum)分别为0.96和-0.14，而在负离子模式下，R2Y(cum)和Q2(cum)分别为0.99和-0.11。R2Y的斜率大于0，Q2的截距小于0.05，说明该模型具有良好的可预测性，可以在没有过拟合的情况下用于下一步分析。
筛选差异代谢物的结果以火山图的形式可视化，如图3E、F所示。图中的每个点代表一个代谢物。横坐标表示组内与组间相比的多个变化（以2为底部的对数），纵坐标表示学生t检验的p值（以10为底的对数的负数）。散点大小表示OPLS-DA模型的投影变量重要性(VIP)值。散点越大，值越大。散点颜色代表最终筛选结果，红色为显著上调的代谢物，蓝色为显著下调的代谢物，灰色为无显著差异的代谢物。满足以下要求的物质被鉴定为差异代谢物：（1）VIP值>1；(2)显著性差异p < 0.05；(3)按参考文献排除外源性代谢物。结果表明，在AAP膳食补充剂后，我们共筛选出51种差异代谢物作为小鼠血清中的潜在生物标志物。其中，1-20个处于正离子模式，21-54个处于负离子模式。我们在两种模式下均检测到L-赖氨酸、瓜氨酸和硫酸吲哚酚。所选生物标志物的详细信息见表1。
图3 通过血清代谢组学鉴定黑木耳多糖摄入后的生物标志物
(A)正离子模式和(B)负离子模式下的OPLS-DA得分图；(C)正离子模式和(D)负离子模式下的OPLS-DA置换试验（200次）；R2的斜率大于0，Q2在Y轴上的截距小于0.05，说明模型有效；(E)正离子模式和(F)负离子模式下差异代谢物筛选火山图。ND =正常饮食；AAP =黑木耳多糖。数据表示为平均值± SD，n = 6。
4. 黑木耳多糖摄入后小鼠血清生物标志物的变化
我们基于差异代谢物的定量值计算欧几里得距离矩阵；使用全连接法对差异代谢物进行聚类并显示在热图中。在图4A中，横坐标代表不同的实验组，纵坐标代表该组的比较差异代谢物（与表1一致）。不同位置的色块代表相应位置代谢物的相对表达水平。红色表示物质含量高，蓝色表示低。
表1 黑木耳多糖给药后小鼠血清代谢物的鉴定
ND = 正常饮食；AAP = 黑木耳多糖。VIP = 投影变量重要性；↑ = 上调；↓= 下调。
代谢途径分析的结果显示为气泡图（图 4B），其中每个气泡代表一个代谢途径。气泡的横坐标和气泡的大小代表拓扑分析中通路影响因子的大小。尺寸越大，影响越大。气泡所在的垂直坐标和气泡的颜色表示富集分析的p值（负自然对数，即-ln (p)）。颜色越深，p值越小，富集程度越显著。如图4B所示，AAP膳食补充剂引起的差异基因主要富集于精氨酸生物合成途径，相关性最高；其次是精氨酸和脯氨酸代谢；甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；甘油磷脂代谢；和鞘脂代谢途径。
图4 代谢途径分析
(A)血清生物标志物变化的热成像图；(B)气泡图。ND = 正常饮食；AAP = 黑木耳多糖。
5. 黑木耳多糖摄入后小鼠肠道菌群与代谢物的相关性分析
为了进一步研究摄入AAP后小鼠肠道菌群与机体代谢物的相关性，我们通过热图分析了具有大量显著不同菌群（p≤0.01）的代谢物的含量。结果如图 5 所示。食窦魏斯氏菌与以下代谢物呈明显正相关：癸酸、polyoxyethylene (600) monoricinoleate、胍基乙酸、12-oxo-2,3-dinor-10,15-植物二烯酸、2-乙酰基-3,6-二甲基吡嗪、3-甲氧基-4-羟基苯基乙二醇硫酸盐、D-苹果酸、吲哚酚、硫酸吲哚酚、异考布松、苯乙醛酸；与(-)-罗汉松树脂酚、D-核糖、二十碳五烯酸、景天庚酮糖、solasodine也有显著的负相关。约氏乳杆菌和3-甲氧基-4-羟基苯基乙二醇硫酸盐、黄嘌呤核苷、12- oxo-2,3-dinor-10,15-植物二烯酸、癸酸、D-苹果酸、胍基乙酸、马尿酸、异考布松、L-赖氨酸、苯乙醛酸、polyoxyethylene (600) monoricinoleate和反式乌头酸呈正相关，而与(-)-罗汉松树脂酚、D-核糖、二十碳五烯酸和景天庚酮糖呈负相关。我们发现考氏科萨克氏菌与polyoxyethylene (600) monoricinoleate、12-oxo-2,3-dinor-10,15-植物二烯酸、2-乙酰基-3,6-二甲基吡嗪、3-甲氧基- 4-羟基苯基乙二醇硫酸盐、癸酸、D-苹果酸、马尿酸、吲哚酚、异考布松、L-赖氨酸和黄嘌呤呈正相关，而与(-)-罗汉松树脂酚、二十碳五烯酸呈负相关。厚壁菌门细菌M10-2与代谢物如(-)-罗汉松树脂酚、D-核糖、二十碳五烯酸、景天庚酮糖呈正相关，但与异考布松、2-乙酰基-3,6-二甲基吡嗪、苯甲酸、癸酸、胍基乙酸、马尿酸、吲哚酚、硫酸吲哚酚、L-赖氨酸、苯乙醛酸、polyoxyethylene (600) monoricinoleate和黄嘌呤核苷呈负相关。粪肠球菌与下列代谢物呈明显正相关：(R)-二氢马来酰亚胺、12-oxo-2,3-dinor-10,15-植物二烯酸、2-乙酰基-3,6-二甲基吡嗪、苯甲酸、D-苹果酸、吲哚酚、硫酸吲哚酚、L-赖氨酸、苯乙醛酸、polyoxyethylene (600) monoricinoleate和反式乌头酸；与D-核糖、二十碳五烯酸、景天庚酮糖和solasodine也有显著的负相关。动物双歧杆菌和下列代谢物呈正相关：D-苹果酸、反式乌头酸、黄嘌呤核苷、(R)-二氢马来酰亚胺、12- oxo-2,3-dinor-10,15-植物二烯酸、2-乙酰-3,6-二甲基吡嗪、3-甲氧基-4-羟基苯基乙二醇硫酸盐、马尿酸、吲哚酚、吲哚酚硫酸盐、异考布松、L-赖氨酸、苯基乙醛酸和polyoxyethylene (600) monoricinoleate；与(-)-罗汉松树脂酚、D-核糖、二十碳五烯酸、景天庚酮糖、solasodine也有显著的负相关。同形拟杆菌和硫酸吲哚酚，(R)-二氢马来酰亚胺，12- oxo-2,3-dinor -10,15-植物二烯酸，2-乙酰基-3,6-二甲基吡嗪、苯甲酸、D-苹果酸、吲哚酚、异考布松、L-赖氨酸、苯乙醛酸、polyoxyethylene (600) monoricinoleate、反式乌头酸和黄嘌呤呈显著正相关；与(-)-罗汉松树脂酚和二十碳五烯酸呈负相关。
图5 特征菌与代谢物的相关性分析
corr =相关性。红色代表正相关，蓝色代表负相关。颜色越深，相关性越大。*表示p < 0.05。
讨论
联合国提出“一肉一菜一菇”作为21世纪的合理膳食结构。多糖是由10多种单糖通过糖苷键聚合而成，具有高安全性和低毒性。来自食用菌和药用菌的多糖被认为是“生物反应调节剂”。目前已发现100多种食用和药用真菌多糖：抗氧化、降糖、降血脂、免疫调节、抗肿瘤、保肝、其中香菇、灵芝、冬虫夏草和银耳已广泛应用于医药、生命科学和食品领域。由于缺乏酶，大部分食用和药用真菌多糖不能被人体直接消化吸收，而肠道菌群编码的CAZymes可以将寡糖和多糖转化为单糖，从而产生易于吸收的SCFAs和其他代谢物。此外，不同种类的多糖可以增加有益肠道微生物，减少有害肠道微生物。HAO等人发现，给予金针菇多糖28天后，C57BL/6J小鼠盲肠中厚壁菌门的丰度增加，而拟杆菌的丰度下降，从而增加了厚壁菌门与拟杆菌的比例。KHAN等人研究了灵芝多糖和茯苓多糖对C57BL/6J小鼠肠道菌群的影响；他们发现两种可食用和药用的真菌多糖增加了SCFAs和乳酸的产生，以及抗肥胖的益生菌的丰度，例如双歧杆菌、直肠真杆菌、乳酸杆菌和乳球菌。此外，病原菌比例降低，从而起到益生元的作用。本研究的结果表明，膳食补充剂AAP改变了C57BL/6J雄性小鼠的肠道菌群组成，显著上调了约氏乳杆菌、食窦魏斯氏菌，考氏科萨克氏菌、粪肠球菌、动物双歧杆菌和同形拟杆菌，同时下调厚壁菌门细菌M10-2的相对丰度。
哺乳动物的肠道内有数以亿计的细菌群落，它们相互依存于宿主，参与各种生理活动：新陈代谢、免疫、内分泌和神经系统功能的调节。新出现的证据表明，低度炎症是肥胖、2型糖尿病和非酒精性脂肪肝等代谢紊乱的标志。这些疾病的特点是肠道微生物群及其代谢物的变化，它们从肠道通过受损的肠道屏障迁移，影响肝脏和脂肪组织等代谢器官。其他研究发现，肥胖、体重增加倾向、血脂异常、胰岛素抵抗和轻度炎症在肠道细菌丰富度低的受试者中更为普遍。此外，有人提出某些“促炎”细菌菌株，如活泼瘤胃球菌或拟杆菌属物种，可能占主导地位，而“抗炎”菌株，如普拉梭菌，丰度相对不高。乳酸菌(LAB)以对健康有益而闻名。大量研究表明，乳酸菌具有抗氧化、调节免疫功能、降低胆固醇、促进消化和预防癌症的作用；因此，纳入饮食可能是有积极意义的。根据定义，乳酸菌使用碳水化合物产生大量乳酸。乳球菌属、肠球菌属、片球菌属、明串珠菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、漫游球菌属、Tetragenococcus和魏斯氏菌属是一些乳酸菌属，它们的健康益处已得到充分研究。作为益生菌，约氏乳杆菌在维持肠道菌群平衡和调节免疫系统方面发挥着重要作用。研究发现，它促进动物的生长发育，减少炎症反应，预防腹泻，增加肠道有益菌的数量，调节肠道菌群平衡。约氏乳杆菌定植后，小肠和脾脏中CD4+和CD8+细胞数量最多。虽然不如粪便细菌移植有效，但大肠杆菌和约氏乳杆菌定植均增加了调节性T细胞(Tregs)和活化DC的比例，并在第28天完全恢复了肠道记忆/效应T细胞群。只有约氏乳杆菌重新定殖维持结肠IL-10的产生。其他研究表明，约氏乳杆菌会增加血液中还原型谷胱甘肽的水平，从而通过降低肝脏脂质和改善全身葡萄糖代谢来促进肝脏的线粒体形态和功能。食窦魏斯氏菌是酸菜自然发酵早期发现的优势异型乳酸发酵菌。由于发酵的复杂性和产品的多样性，它可以产生更多的风味物质，使酸菜具有更好的风味。Shashank等人从发酵的dosa batter和人类婴儿粪便样本中分离出四种新的Weiss菌株，并发现所有四种都能耐受胃液（pH = 3.0）和胆汁盐，细胞表面疏水性适中，可降低胆固醇，并粘附于Caco-2细胞和胃粘蛋白。细胞实验证明，所有四种菌株均抑制脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞产生一氧化氮和IL-6，并抑制人上皮细胞中IL-8的产生。本研究发现，膳食补充AAP可显著上调约氏乳杆菌和食窦魏斯氏菌的丰度，但其基于肠道菌群调节的健康促进作用有待进一步探索。
不同的多糖促进不同肠道菌群的生长，这与多糖的结构有关。相对分子质量是影响多糖生物活性的重要因素。You等人比较了三种褐藻多糖（海藻酸盐、海带多糖、褐藻糖胶）的结构信息、消化行为和对肠道菌群的影响，发现低分子量多糖对肠道菌群的调节作用更大。Deng等人探索了低、中、高分子量魔芋葡甘聚糖（KGM）的理化性质、降血糖作用和机理分析，发现中等分子量改变了厚壁菌门与拟杆菌门的比例，降低了Roma Boots和克雷伯氏菌的丰度。在KGM-H (1129.5 kDa)、KGM-M1 (757.1 kDa)、KGM-M2 (252.7 kDa)和KGM-L (87.3 kDa) 组中，拟杆菌的数量分别增加了6.14%、24.2%、18.38%和12.28%。此外，多糖的有益作用与单糖类型密切相关。从燕麦中提取的β-葡聚糖增加了肠道菌群中双歧杆菌和乳酸杆菌的数量。拟杆菌能有效降解果聚糖；木聚糖由Prevotella bryantii代谢。本研究采用热水提取法制备的秦巴山黑木耳多糖主要由甘露糖组成（甘露糖、葡萄糖醛酸和木糖的相对摩尔百分比为60.87：20.83：9.86），并且其对肠道菌群的调节作用可能与甘露糖密切相关。研究发现，甘露糖不仅是哺乳动物蛋白质糖基化的重要单糖，也是一种低效的细胞能量来源。补充一定量的甘露糖可以增加高脂饮食小鼠肠道菌群中拟杆菌与厚壁菌的比例。小鼠盲肠微生物区系的功能转录组分析表明，甘露糖诱导了微生物能量代谢的连贯变化，据推测，它的作用来自减少肠道微生物群产生的能量，这些微生物群代谢复杂的碳水化合物并减少能量摄入。此外，Li等人还分析了四种分子量、聚合糖苷键、酯化、分支和单糖组成差异显著的半乳糖(卟啉、琼脂糖、卡拉胶和阿拉伯半乳糖)对肠道菌群和短链脂肪酸产生的影响。结果表明，四种半乳糖均可被肠道拟杆菌使用。此外，卟啉可用于乳酸杆菌和双歧杆菌，而阿拉伯半乳聚糖可用于乳酸杆菌、双歧杆菌和罗氏杆菌。尽管大量研究证实多糖的结构影响其对各种肠道菌群的调节功能，但肠道微生物如何根据其结构特征使用不同类型的多糖仍有待进一步研究。由于缺乏对一级和二级多糖结构的研究，食药用真菌来源不同，多糖提取方法不同，缺乏相应的质量控制指标，影响了实验的可重复性，增加了药用和营养品开发的难度。
人体依靠肠道菌群的糖酵解，从食物中吸收自身酶无法消化的营养物质，获得能量。同时，肠道菌群调节机体的正常生理功能和疾病的发生发展。本研究基于代谢组学平台，对秦巴山区AAP喂养小鼠血清内源性代谢物谱进行系统分析，分析AAP摄入后肠道菌群显著变化与代谢差异的相关性。结果表明，AAP对血清代谢物谱具有显著的调节作用，代谢产物与约氏乳杆菌、食窦魏斯氏菌，考氏科萨克氏菌、粪肠球菌、动物双歧杆菌、同形拟杆菌和厚壁菌门菌M10-2具有显著相关性。摄入AAP后，差异基因主要富集在精氨酸生物合成途径中，相关性最高。L-精氨酸是一种碱性半必需氨基酸。当动物身体受伤（尤其是肝脏）或应激时，大量的精氨酸酶被释放到血液中，加速精氨酸的消耗，这也会导致精氨酸的缺乏。一种是精氨酸酶催化氨生成鸟氨酸和尿素，又称尿素循环，也是氨代谢的重要手段。代谢产生的尿素通过尿液排出体外，尿素循环的主要部位是肝脏。鸟氨酸可被鸟氨酸脱羧酶脱羧生成腐胺，它进一步与S-腺苷甲硫氨酸反应生成亚精胺和精胺。腐胺、亚精胺和精胺统称为多胺，是能调节机体DNA和蛋白质合成，从而促进细胞增殖和分化的物质。第二种途径是精氨酸脱羧酶催化形成胍丁胺，它已被证明是一种新的神经递质，可以影响激素的释放，促进淋巴细胞和胸腺细胞的增殖。胍丁胺可以在胍丁胺酶的催化下产生腐胺，这也是体内产生多胺的另一种方式。第三种是精氨酸催化生成胍基乙酸：甘氨酸转移酶和胍基乙酸在胍基乙酸-N-甲基转移酶的催化下甲基化生成肌酸，其主要合成部位为肾脏和胰腺。在血液循环过程中，肌酸可被骨骼肌和神经元吸收，进一步磷酸化形成磷酸肌酸，主要参与骨骼肌的能量代谢。此外，肌酸还可以通过非酶途径不可逆地转化为脱水肌酸酐。精氨酸的最后一个代谢途径是由一氧化氮合酶(NOS)催化产生一氧化氮(NO)和瓜氨酸。NO是哺乳动物组织细胞中的关键调节剂，瓜氨酸可作为底物再生精氨酸。
黑木耳“活性成分-肠道菌群-机体代谢”之间的关系及其对肠道健康和相关代谢疾病的影响尚需进一步研究，以开发和利用食用药用真菌资源。
结论
这项研究表明，非消化性AAPs促进了正常小鼠肠道中约氏乳杆菌、食窦魏斯氏菌，考氏科萨克氏菌、粪肠球菌、动物双歧杆菌和同形拟杆菌的生长。AAP膳食补充后，我们发现51种差异代谢物，主要富集于精氨酸生物合成途径，其次是精氨酸和脯氨酸代谢；甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；甘油磷脂代谢；和鞘脂代谢途径。此外，我们发现差异细菌和差异代谢物之间存在密切相关性，这可能有助于AAP的生物活性；这些结果为进一步开发利用秦巴山区木耳资源和以AAP为主要功能成分的营养食品奠定了理论基础。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36076885/
转自：“如沐风科研”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
