炎症反应是机体抵御组织损伤或病原体不可或缺的防御机制，当细菌、病毒或外毒素等威胁因素出现时，炎症反应被激活，并随这些因素的消退而消退，然而当这些因素持续存在或正常愈合过程受到干扰时，急性炎症反应可能不会消退，而是发展为慢性炎症，损害免疫系统并导致组织严重损伤等病理变化，机械损伤或感染后的组织修复与再生是炎症微环境下受到严格调控的复杂过程[1]。炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）包括克罗恩病（Crohn’s disease，CD）与溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）2种慢性自身免疫性疾病，与环境变化、广泛失调的免疫反应、易感基因变异与肠道微生物群异常等多种致病因素有关[2]。结肠炎相关结直肠癌（colitis associated colorectal cancer，CAC）于1925年已被认定为UC的严重并发症[3]。更长的UC持续时间与CAC风险增加之间存在正相关，据估计，UC的CAC风险在10年后为2%，20年后升至8%，30年后飙升为18%[4]。尽管CAC的发病机制至今尚未完全明确，但UC和CAC的发展过程总是相互交织的，通过UC-发育异常-CAC的序列进展与炎症反应、低度及高度不典型增生的发展有关，炎性介质与免疫调节剂的表达平衡、炎症微环境中不同类型炎性细胞数与活化情况等决定了肿瘤的生长速度与严重程度。特定的促炎信号通路诱导参与调节发育不良上皮细胞中细胞周期检查点的转录因子激活，并且不同的免疫反应导向不同的结果。因此，预防结肠炎对预防结肠癌至关重要。
黄芩汤出自《伤寒论》，清热止痢，和中止痛，常用于治疗湿热下痢，现代广泛应用于IBD的治疗及结肠癌的辅助治疗，临床疗效显著，被誉为“万世治痢之祖方”，诸如葛根芩连汤、甘草芍药汤等止泻名方均由此方加减化裁而来。课题组前期研究发现黄芩汤具有多途径的、效应明确的抗炎、抗氧化应激作用机制[5-6]，提示黄芩汤在对结肠炎具有显著疗效的基础上，或许可以进一步遏制炎症微环境下结肠癌细胞的某些异常机制。为了验证这一假说，本研究构建了体外炎症微环境下结肠癌细胞模型，结合分子生物学的方法，多层次、多方面地进行动态研究，以探究并验证黄芩汤是否可以通过调节相关通路及靶标来改善炎症微环境下结肠癌细胞周期紊乱、上皮间质转化异常等机制。
1 材料
1.1 细胞
人单核型细胞淋巴瘤THP-1细胞、人结肠腺癌HT-29细胞均购自中国医学科学院基础医学研究所实验细胞资源库。
1.2 药材
黄芩、白芍、炙甘草和大枣饮片均购自北京华邈药业有限公司，经中国中医科学院中药研究所李先端研究员分别鉴定为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根、毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根茎炮制后制得、鼠李科植物枣Ziziphus jujuba Mill.的干燥成熟果实。
1.3 药品与试剂
DMEM/F-12培养基（批号01-172-1ACS）购自以色列BI公司；RPMI 1640培养基（批号11875-093）、胎牛血清（批号10099-141）、胰酶（批号25300-054）购自Invitrogen公司；PBS溶液（批号SH30256-01）购自Hyclone公司；二甲基亚砜（批号D2650）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，批号L2880）购自美国Sigma公司；Matrigel基底膜基质（批号356234）购自美国Corning公司；人白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA试剂盒（批号D6050）、人肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA试剂盒（批号DTA00D）购自R&D公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（批号P1200）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号PC0020）购自北京索莱宝科技有限公司；PageRuler Plus Prestained Protein Ladder（批号26619）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；ECL发光试剂（批号WBKLS0500）购自美国Millipore公司；HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体（批号ZB2305）、HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（批号ZB-2301）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；β-actin兔抗鼠单克隆抗体（批号SC-8432）购自SantaCruz公司；兔抗鼠单克隆细胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗体（批号55506）、细胞周期蛋白依赖激酶4（cyclin dependent kinase 4，CDK4）抗体（批号12790）、E-cadherin抗体（批号3195）、糖原合酶激酶-3β（glycogen synthasc kinase-3β，GSK-3β）抗体（批号12456）、海马无翅基因3a（recombinant wingless type MMTV integration site family member 3a，Wnt3a）抗体（批号2721）、β-连环蛋白（β-catenin）抗体（批号8480）购自美国CST公司；动物组织/细胞总RNA提取试剂盒（批号DP452）购自天根生化科技（北京）有限公司；TB Green® Premix Ex Taq™ Ⅱ（Tli RNaseH Plus）酶试剂盒（批号RR420B）、PrimeScript™ RT reagent Kit（Perfect Real Time）试剂盒（批号RR037B）购自Takara公司。
1.4 仪器
HH系列数显恒温水浴锅（金坛市科析仪器有限公司）；涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；MCO-15AC型CO2培养箱（日本Sanyo公司）；倒置光学显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司）；SW-CJ-1FD型垂直净化工作台（苏州智净净化设备有限公司）；4600SF型全自动凝胶发光图像分析系统（上海Tanon公司）；蛋白质电泳转印系统（美国Bio-Rad公司）；LightCycler® 480 Real-Time PCR仪（瑞士Roche公司）；NanoDrop 8000分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）。
2 方法
2.1 黄芩汤的制备
参照《伤寒论》组方及课题组的前期研究[7]，黄芩汤由黄芩、芍药、甘草和大枣配伍而成，按照3∶2∶2∶2的比例，称取一定量的药材，加入10倍体积的水，煎煮1 h后，趁热滤过药液；药渣加8倍体积的水继续煎煮1 h时，合并2次药液，浓缩成1 g/mL药液。经指纹图谱相似度和多成分含量分析控制[8]，提取率约为38.89%，与对照图谱相似系数为0.998，主要含黄酮和萜类化合物，含黄芩苷10.094%、汉黄芩苷2.334%、千层纸素A苷0.953%、黄芩素0.411%、汉黄芩素0.149%、千层纸素A 0.093%、甘草素二糖苷0.790%、甘草苷0.344%、异甘草素二糖苷0.036%、甘草素0.032%、异甘草苷0.060%、异甘草素0.003%。
2.2 细胞培养
HT-29细胞为贴壁培养细胞系，用含5%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM/F-12培养基，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。THP-1细胞为悬浮细胞系，用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的RPMI 1640培养基，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。当细胞生长至培养瓶面积80%以上时，消化传代，取处于对数生长期的细胞进行实验。
2.3 条件培养基制备
取对数生长期的THP-1细胞，调整细胞密度为1×106个/皿，加入1 µg/mL LPS，于培养箱中培养过夜。收集细胞上清并离心后，按照ELISA试剂盒说明书检测IL-6、TNF-α水平；收集上清与含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基按1∶2比例混合均匀后制得条件培养基。
2.4 细胞模型制备
取对数生长期的HT-29细胞，使用条件培养基重悬细胞并调整细胞密度为1×106个/皿，培养箱中培养24 h，制得细胞模型用以后续实验。
2.5 MTT检测细胞增殖
收集细胞，将细胞密度调整为1×106个/皿，接种于无菌96孔板中，培养箱中培养过夜。次日，镜下观察细胞单层铺满培养板孔底后，每孔加入100 µL不同质量浓度（1250、625、312.5、156.25、78、39、19.5、9.8 µg/mL）黄芩汤溶液，另设置接种细胞不含药物的对照孔以及未接种细胞不含药物的空白孔，培养24 h后，镜下观察药物的作用效果，每孔加入100 µL MTT（5 mg/mL），培养4 h后，每孔加入200 µL二甲基亚砜，镜下观察结晶物充分溶解后，在490 nm处测定吸光度（A），计算抑制率。
抑制率＝1－(A给药－A空白)/(A对照－A空白)
2.6 细胞迁移实验
收集细胞，用不含胎牛血清、含不同质量浓度（125、250、500 µg/mL）黄芩汤的DMEM/F-12培养基将细胞密度调整为1×105个/皿，取200 µL细胞悬液加入孔径8 µL的Transwell上室中，下室中加入600 µL含20%胎牛血清的DMEM/F-12培养基，另设置不含药物的对照组，培养24 h后，使用0.1%结晶紫染色10 min，晾干后镜下计数上室微孔膜下层的细胞数目，随机选取多个视野，记录平均值。
2.7 细胞侵袭实验
收集细胞，用不含胎牛血清、含不同质量浓度（125、250、500 µg/mL）黄芩汤的DMEM/F-12培养基，将细胞密度调整为1×105个/皿，取200 µL细胞悬液加入孔径8 µL的含Matrigel胶的Transwell上室中，下室中加入600 µL含20%胎牛血清的DMEM/F-12培养基，另设置不含药物的对照组，培养24 h后，使用0.1%结晶紫染色10 min，晾干后镜下计数上室微孔膜下层的细胞数目，随机选取多个视野，记录平均值。
2.8 Western blotting检测蛋白表达
使用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，封闭后加入一抗（1∶1000），摇床4 ℃孵育过夜；洗膜后，加入二抗（1∶5000），摇床室温孵育1.5 h，显影拍照，使用Image J软件进行灰度值分析。
2.9 qRT-PCR检测mRNA表达
按照试剂盒说明书提取细胞总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。引物由上海Sangon有限公司提供，引物序列见表1。
2.10 统计学分析
使用GraphPad Prism 9.0软件对数据进行统计分析，数据以表示，组间比较采用One-way ANOVA检验。
3 结果
3.1 黄芩汤对炎症微环境下HT-29细胞增殖能力的影响
如图1所示，使用LPS诱导后的THP-1细胞上清液中炎性因子IL-6与TNF-α水平均显著升高（P＜0.01），符合条件培养基制备要求。细胞模型给予黄芩汤处理24 h后，如图2所示，随着黄芩汤质量浓度（9.8～156.25 µg/mL）的增加，细胞抑制率逐渐上升；当质量浓度高于156.25 µg/mL时，随着黄芩汤质量浓度的增加，细胞抑制率不再上升，因此选用500、250、125 µg/mL进行后续实验。
3.2 黄芩汤对炎症微环境下HT-29细胞迁移能力的影响
如图3所示，与对照组比较，黄芩汤中、高剂量组细胞数目显著减少（P＜0.01），表明黄芩汤可有效抑制炎性条件下HT-29细胞的迁移能力。
3.3 黄芩汤对炎症微环境下HT-29细胞侵袭能力的影响
如图4所示，与对照组比较，黄芩汤中、高剂量组细胞数目显著减少（P＜0.01），表明黄芩汤对炎性条件下HT-29细胞的侵袭能力有显著抑制作用。
3.4 黄芩汤对炎症微环境下HT-29细胞cyclin D1、CDK4、E-cadherin、β-catenin、GSK-3β和Wnt3a蛋白表达的影响
如图5所示，与对照组比较，黄芩汤中、高剂量组细胞中E-cadherin、GSK-3β蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01），CDK4、β-catenin、Wnt3a蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01）；黄芩汤各剂量组cyclin D1蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01）。
3.5 黄芩汤对炎症微环境下HT-29细胞cyclin D1、CDK4、E-cadherin、β-catenin、GSK-3β和Wnt3a mRNA表达的影响
如图6所示，与对照组比较，黄芩汤各剂量组细胞E-cadherin、GSK-3β mRNA表达水平均显著升高（P＜0.01），β-catenin、cyclin D1、CDK4 mRNA表达水平均显著降低（P＜0.01）；黄芩汤中、高剂量组Wnt3a mRNA表达水平显著降低（P＜0.01）。
4 讨论
早在1863年Ruldolf Virchow就曾描述过炎症在癌症发展中的作用，他基于肿瘤组织发现炎性细胞浸润的观察结果提出“癌症起源于淋巴浸润的炎症部位”的假设[9]。近年来有大量研究显示，炎症可通过为浸润在肿瘤微环境中的细胞提供生物活性分子来增加患癌风险，如生长因子、细胞持续增殖有关的趋化因子、抑制细胞凋亡信号、细胞外基质修饰酶等，还可促进上皮间质转化异常、细胞周期紊乱、基因组变异、能量代谢重排等程序。长期的炎性浸润会诱发结肠黏膜的遗传损伤，使组织过度修复，肠上皮细胞增生异常，最终导致结肠癌。
上皮间质转化是机体发育的关键环节，常在伤口愈合、组织纤维化和癌症进展中被重新激活，对于保护机体免受病原体侵害并去除坏死组织至关重要[10-12]。在上皮间质转化发生时，上皮细胞发生外形变化并丧失其极性连接被解构，连接蛋白被重新定位和/或降解，E-cadherin在质膜上的表达被抑制是胞间黏连不稳定进程的重要标志[13]，同时这也意味着β-catenin失去了与E-cadherin的相互作用[14]。后续随着上皮间质转化的逐步进展，连接蛋白的表达被Wnt信号调控的异常转录所抑制，细胞发生突起，且运动性增加、胞间连接丧失、细胞外基质降解[15-16]，因此Wnt信号通路已成为治疗结肠癌最重要的分子靶点之一[17]。核β-catenin水平升高被认为是侵袭性结肠癌的标志。β-catenin破坏复合物[包括腺瘤性结肠息肉病蛋白（adenomatosis polyposis coli，APC）、轴抑制蛋白（axis inhibitor，Axin）、酪蛋白激酶1（casein kinase 1，CK1）和GSK-3β]的突变或失调导致Wnt相关靶点的激活[包括c-myc、cyclin D1、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和MMP-9]，从而增强细胞的增殖、侵袭和迁移能力[18-21]。本研究推测黄芩汤可能通过稳定β-catenin的突变来对抗泛素-蛋白体系统的降解，减少GSK-3β释放，使β-catenin在细胞核中的累积及磷酸化进程被抑制，进而调控下游目标基因激活，同时黄芩汤还可抑制IL-1β的表达来稳定上皮间质转化相关因子Snail，延缓上皮间质转化过程。因此，黄芩汤可能具有靶向Wnt途径及其相关成分来调节上皮间质转化进程异常的潜力。
组织稳态的维持依赖于细胞分裂和死亡2个主要的生理过程。依靠这2种机制，细胞对组织损伤做出响应，并根据组织的修复需求进行增殖，细胞增殖是机体发育、维持体内平衡、组织再生、DNA修复和细胞凋亡等事件相关的微调序列[22]。细胞增殖过程中的阶段序列称为细胞周期，细胞周期通过其调控作用来限制有丝分裂后2个新细胞中不会出现遗传物质的增加或损失。细胞周期进程分为4个有序阶段，其进程高度保守且受控，分别为G0期（间隙期)、S期（DNA合成）、G2期（有丝分裂准备期）、M期（遗传物质和胞质分裂）。目前已知进入细胞周期的细胞受到G1/S、G2/M和有丝分裂纺锤体3个检查点的控制[23]。其中，G1/S转变是一个关键的限制点，导致细胞未来的3种命运走向——继续循环、退出活跃增殖或进入G0期。细胞必须通过严格调节的限制点检查来调节从G1期进入S期并开始DNA复制的过程[24]。根据经典的细胞周期模型，G1/S期间的转换起始于G1期的早期阶段，此时有丝分裂刺激（通过生长因子受体激活）和抑制之间的平衡更偏向于G1阶段，进而引发D型细胞蛋白（cyclin D1、D2和D3）表达水平增加。随后D型细胞蛋白与CDK4/6结合，构成cyclin D-CDK复合物进入细胞核，被CDK激活激酶复合物磷酸化。CDK4/6在第一间隙期（G1期）的酶活性由cyclin D控制，从而对各种细胞外信号，包括刺激性有丝分裂原、抑制性细胞因子、分化诱导剂、胞间黏附等做出反应[25]。CDK/cyclin途径的失调主要表现为绕过了常用以严格控制细胞增殖并确保基因组准确性的检查点，进而允许组织不受限制的生长，最终发生发展为肿瘤[26-28]。本研究结果显示，结肠癌HT-29细胞在炎症微环境下出现CDK4与cyclin D1的蛋白表达失调与转录异常，而黄芩汤可部分逆转转化后的表型，可能是通过抑制cyclin D1与CDK4的活性来进一步调控细胞周期检查点失常导致的不受控的细胞生长。这些结果也证实了cyclin D1/CDK4确实是细胞增殖过程中的重要靶点，黄芩汤作为这些靶点的有效抑制剂可能会对结肠癌进程中的细胞周期异常产生有意义的治疗作用。
本研究发现，黄芩汤可显著抑制炎症微环境下结肠癌HT-29细胞的迁移与侵袭，并通过调控依赖于β-catenin的经典Wnt通路相关位点E-cadherin、GSK-3β、Wnt3a来干预上皮间质转化异常，同时还可通过有效抑制cyclin D1、CDK4 2种细胞周期蛋白的表达试图修复周期检查点。这些药效靶标与炎症微环境下的损伤修复诱使遗传物质变化进而发生细胞不受控增殖导致的肿瘤密切相关，黄芩汤可通过调节周期控制失调及快速生长分裂来干预永久性的基因组改变。为进一步深入研究黄芩汤干预CAC的药效作用及相关机制奠定了理论基础。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：马旭冉，王敦方，冯 雪，刘雅清，刘 滨，杨伟鹏．基于Wnt信号通路研究黄芩汤干预炎症微环境下结肠癌细胞上皮间质转化与细胞周期进程的作用机制 [J]. 中草药, 2023, 54(7):2155-2162.
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