帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是当前世界范围内最常见的神经退行性疾病之一[1]，其主要病理特征为中脑黑质-纹状体通路出现多巴胺（dopamine，DA）能神经元的进行性退化。PD患者会出现静止性震颤、运动迟缓等运动症状[2]，以及睡眠障碍、胃肠道功能障碍等非运动症状[3]。有30%的PD患者在运动功能障碍和中枢神经系统（central nervous system，CNS）疾病出现前就出现肠道神经系统（enteric nervous system，ENS）失调。在近些年的研究中，不断有证据为“PD可能是肠源性疾病”这一假说提供支持[4]。
中医“脾胃学说”与脑有着密切的联系，脾胃为气血生化之源，能升清降浊以营养全身，若其代谢失常，则脑神失养，导致众多脑病[5]。甘松为败酱科植物甘松Nardostachys jatamansi DC.的干燥根及根茎，是我国传统中药材，收录于《中国药典》2020年版一部[6]，入脾、胃经，有“醒脾”“行气”“健胃”等功效。马云枝教授认为脾虚湿阻、痰瘀互结是PD发生的主要病机，甘松既有“醒脾”之功，便有其统摄之效[7]。临床上常使用甘松与石菖蒲配伍治疗脾虚痰盛型原发性癫痫[8]。传统观点认为PD与“肝风”相关[5]，PD患者久病则郁，有因病致郁，或因病使郁加重，甘松既有“行气”之功，便有其治疗之效。中医理论中，胃与脑通过经气直接相连，胃气的变动可以直接影响到脑的功能[9]，甘松既有“健胃”之功，便有其滋养之效。临床归纳甘松广泛应用于疏解久病之郁，调理脾胃之气，芳香避秽醒脑[10]。此外，现代药理学研究表明，甘松对各种神经、精神疾病有较好的神经保护作用[11]，包括抗PD[12]和阿尔兹海默[13]等神经退行性疾病、抗抑郁[14]和镇静[15]等。
课题组前期研究发现甘松80%乙醇提取物可以调节PD大鼠肠道菌群，从而干预PD相关病理症状[16]，但尚缺乏基于中医基础理论探讨甘松抗PD机制的研究。因此，本研究拟采用鱼藤酮致大鼠PD模型，通过旷场实验、斜板实验以及大鼠纹状体DA含量考察不同剂量甘松80%乙醇提取物对PD大鼠运动障碍的改善能力，筛选甘松抗PD最优剂量；在“肠-脑轴”理论的指导下，采用Western blotting和ELISA实验检测PD大鼠结肠和纹状体中神经递质的含量、肠道胶质细胞标志物和神经胶质细胞标志物的表达情况，探究甘松抗PD的作用机制，为将“脾胃学说”和“肠-脑轴”理论相结合治疗PD的研究奠定基础。
1 材料
1.1 动物
SPF级SD雄性大鼠，体质量200～220 g，由维通利华（北京）实验技术有限公司提供，动物许可证号SCXK（京）2016-0006，饲养于北京中医药大学实验动物部标准屏障环境内，自由饮食，明暗节律12 h/12 h。进行实验前，大鼠给予不受限制的标准饲料和洁净饮用水。动物实验遵守国际实验动物伦理学要求，已由动物伦理委员会批准，批准编号为BUCM-4-2020091407-3055。
1.2 药材
甘松药材购自四川阿坝若尔盖县，经北京中医药大学中药鉴定教研室石晋丽教授鉴定为败酱科缬草属植物甘松N. jatamansi DC.的干燥根及根茎。
1.3 药品与试剂
鱼藤酮（批号R105076）购自上海阿拉丁生化科技有限公司；葵花籽油（批号W24A11L122237）购自上海源叶生物科技有限公司；左旋多巴（批号H11021055）购自北京曙光药业有限责任公司；乌拉坦（批号C10821103）购自上海麦克林科技有限公司；4%多聚甲醛（批号70120900）购自北京兰杰柯科技有限公司；双氧水（批号10011218）购自国药集团化学试剂有限公司；PBS缓冲液（批号B0002）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号Ba1086）、柠檬酸（pH 6.0）抗原修复液（批号B2010）、苏木素染液（批号B1001）购自BQD公司；酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗体（批号GB11181）购自Servicebio公司；二甲苯（批号10023418）购自国药集团化学试剂有限公司；离子钙结合蛋白1（ionized calcium binding adaptor molecule-1，Iba-1）抗体（批号17198s）购自美国CST公司；HRP标记的山羊抗兔二抗（批号074-1506）、HRP标记的山羊抗小鼠二抗（批号074-1806）购自美国KPL公司；β-actin抗体（批号ab227387）购自英国Abcam公司；蛋白Marker（批号26616）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；大鼠DA ELISA试剂盒（批号20210618AS1）、大鼠3,4-二羟基苯乙酸（3,4-dihydroxyphenlaceticacid，DOPAC）ELISA试剂盒（批号20210618AS1）、大鼠高香草酸（hemovanillic acid，HVA）ELISA试剂盒（批号20210618AS1）、大鼠5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）ELISA试剂盒（批号20210618AS1）、大鼠5-羟吲哚乙酸（5-hydroxyindole acetic acid，5-HIAA）ELISA试剂盒（批号20210618AS1）购自江苏酶免有限公司；胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗体（批号16825-1-AP）购自美国Proteintech公司。
1.4 仪器
SB-5200DTD型超声清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；ME104E/02型十万分之一电子天平[梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司]；FW-200型高速万能粉碎机（北京科伟永兴仪器有限公司）；HW.SY21-KP4型智能恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司）；RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；JY96-IIN型超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；旷场、斜板均为实验室自制。
2 方法
2.1 甘松样品的制备
将甘松药材粉碎成粗粉，称取100 g置于具塞锥形瓶中，分别用10、8、8倍量的80%乙醇超声提取3次，时间分别为60、45、45 min，温度控制在35 ℃以下，滤过，合并滤液，减压回收溶剂，得棕色浸膏10.5 g，出膏率为10.5%，冷冻真空干燥。甘松醇提物中主要含有萜类、黄酮类和香豆素类化合物，其中倍半萜类成分甘松新酮的质量分数为0.109%～2.013%，总黄酮质量分数为1.01%～2.18%[17]。
2.2 大鼠PD模型制备
将鱼藤酮粉末溶于葵花籽油中，配成1.5 mg/mL的乳化液，SPF级SD大鼠适应性饲养1周后，连续2周颈背部sc鱼藤酮（1.5 mg/kg），选取PD评分2～4分大鼠纳入实验，评分标准见表1。按照评分标准筛选造模成功的大鼠，少数大鼠对鱼藤酮较为敏感，中毒症状严重，出现瘫痪、不能进食等危害生命的症状，基于动物伦理的考虑，对6～8分大鼠进行及时处死。
2.3 分组及给药
将造模成功的大鼠随机分为模型组、左旋多巴组和甘松低、中、高剂量组，每组7～8只，另设置对照组大鼠8只。以前期课题组对甘松不同溶剂提取物抗大鼠帕金森运动功能研究中所用剂量作为中剂量[18]，另设低、高剂量，分别为中剂量的2/3、3/2倍，即分别为0.41、0.62、0.93 g/kg生药。左旋多巴类药物是临床治疗PD的首选药物[19]，能有效缓解PD患者的运动功能障碍，故左旋多巴组为阳性对照组，根据左旋多巴临床用量确定给药剂量50 mg/kg。
2.4 行为学实验
2.4.1 旷场实验 选择规格为100 cm×100 cm×45 cm的正方形箱作为旷场，将其底部划分为25个方格（20 cm×20 cm），将大鼠置于旷场实验箱正中央，观察大鼠在5 min内旷场自由活动的总路程。大鼠运动总路程越长，证明运动功能障碍越小。
2.4.2 斜板实验 参照Rivlin等[20]方法自制斜板，斜板由2个矩形木板靠铰链连接，作为底板的木板不动，通过铰链连接另一块可活动木板，上附1 cm厚的橡胶垫。将大鼠头朝上，垂直放于可活动木板的橡胶垫上，从夹角为50°开始，若大鼠可在斜板上停留5 s，则升高斜板角度5°，直至停留时间小于5 s，记录此角度作为斜板停留角度。每只大鼠测量3次，取测量平均值。大鼠停留角度越高，证明运动功能障碍越小。
2.5 免疫组化检测大鼠黑质中TH的表达
行为学实验结束后，各组大鼠禁食、不禁水12 h，ip 20%乌拉坦麻醉，剪开大鼠的胸腔，将灌注针插入心脏左心室，剪开右心耳进行心脏灌注操作。在冰上迅速剥离出完整的大脑，浸泡于10倍体积的多聚甲醛溶液中静置24 h。然后进行石蜡包埋，冠状面切片，梯度酒精脱水，染色，拍照，并将
导入至Image J软件中，对阳性细胞的吸光度（A）值及区域总面积的比值进行分析，得到TH的平均A值，以确定其表达情况。
2.6 ELISA检测大鼠结肠和纹状体中DA、DOPAC、HVA、5-HT和5-HIAA的含量
按照ELISA试剂盒说明书检测各组大鼠结肠和纹状体中DA、DOPAC、HVA、5-HT、5-HIAA水平。
2.7 Western blotting检测大鼠结肠和纹状体中Iba-1、GFAP的表达
将大鼠结肠、纹状体组织用4 ℃的PBS缓冲液漂洗3次，加入10倍体积的组织蛋白提取试剂，置于匀浆器中匀浆，待匀浆液完全裂解，收集上清液，使用BCA定量法对蛋白总浓度进行测定。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，TBST洗涤，用5%脱脂牛奶封闭1 h，TBST洗涤3次，每次5 min；加入一抗（1∶6000），4 ℃孵育过夜；TBST洗涤3次，每次5 min，加入二抗（1∶50 000），室温孵育30 min，TBST洗涤4次，每次5 min。采用ECL化学发光法显影，使用Image J分析蛋白条带灰度值。
2.8 统计分析
数据应用GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析，计量资料以表示，实验结果服从正态分布时，组间比较采用单因素方差分析，差异有显著性时利用Dunnett’s检验进行多重比较分析。
3 结果
3.1 甘松抗PD大鼠运动功能障碍最优剂量选择
3.1.1 甘松对PD大鼠旷场实验的影响 如表2所示，与对照组比较，模型组大鼠旷场总运动距离显著缩短（P＜0.001）；与模型组比较，各给药组大鼠旷场总运动距离均显著增加（P＜0.05、0.01、0.001），其中甘松中剂量组最佳，表明甘松中剂量组对PD大鼠自主活动能力的改善最为显著。
3.1.2 甘松对PD大鼠斜板实验的影响 如表3所示，与对照组比较，模型组大鼠上肢力量不足、停留角度显著降低（P＜0.001）；与模型组比较，各给药组大鼠上肢协调能力显著改善，斜板停留角度显著升高（P＜0.01、0.001），其中甘松中剂量组最佳，表明甘松中剂量组对PD大鼠运动协调能力的改善最为显著。
3.1.3 甘松对PD大鼠纹状体DA含量的影响 如表4所示，与对照组比较，模型组大鼠纹状体中DA含量显著降低（P＜0.001）；与模型组比较，各给药组大鼠纹状体DA含量显著升高（P＜0.05、0.01、0.001），其中甘松中剂量组作用最佳。
3.2 甘松抗PD大鼠运动功能障碍的机制探究
3.2.1 甘松对PD大鼠黑质TH表达的影响 如图1、表5所示，模型组大鼠中脑黑质区域TH阳性神经元表达明显下降（P＜0.05），胞体轮廓不清晰且胞体显著缩小；经左旋多巴给药后，PD大鼠TH阳性表达明显升高（P＜0.05），胞体缩小较少；经甘松给药后，PD大鼠TH阳性表达显著升高（P＜0.01），表明甘松可有效抑制PD大鼠黑质TH阳性神经元的减少。
3.2.2 甘松对PD大鼠结肠中神经递质含量的影响 如表6所示，与对照组比较，模型组大鼠结肠中神经递质DA、DOPAC、HVA、5-HT和5-HIAA含量显著降低（P＜0.01、0.001），DA代谢速率（DOPAC＋HVA）/DA显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，左旋多巴组DA、DOPAC和HVA含量均显著升高（P＜0.05），甘松组DA、DOPAC、HVA、5-HT和5-HIAA含量显著升高（P＜0.01、0.001），DA代谢速率显著降低（P＜0.05）。
3.2.3 甘松对PD大鼠纹状体中神经递质含量的影响 如表7所示，与对照组比较，模型组大鼠纹状体中DA、DOPAC、HVA、5-HT和5-HIAA含量显著降低（P＜0.01、0.001），DA代谢速率（DOPAC＋HVA）/DA显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，左旋多巴组DA、HVA含量显著升高（P＜0.01），DA代谢速率降低；甘松组DA、DOPAC、HVA、5-HT和5-HIAA含量显著升高（P＜0.05），DA代谢速率降低，表明甘松能起到抑制PD大鼠DA、5-HT神经递质含量下降的作用，并降低DA代谢速率。
3.2.4 甘松对PD大鼠肠神经胶质细胞的影响 如图2、表8所示，与对照组比较，模型组大鼠结肠组织Iba-1、GFAP蛋白表达水平均显著升高（P＜0.001）；与模型组比较，各给药组结肠组织Iba-1、GFAP蛋白表达水平均显著降低（P＜0.001），表明肠神经胶质细胞的过度激活得到了有效抑制。
3.2.5 甘松对PD大鼠神经胶质细胞的影响 如图3、表9所示，与对照组比较，模型组大鼠纹状体中神经胶质细胞的标志物Iba-1、GFAP的表达水平显著升高（P＜0.001）；与模型组比较，左旋多巴和甘松醇提物可显著降低Iba-1、GFAP的表达（P＜0.001），表明甘松能够有效抑制神经胶质细胞的过度激活。
4 讨论
本研究考察了甘松80%乙醇提取物低、中、高剂量对鱼藤酮致PD大鼠运动功能障碍的改善作用和对PD大鼠纹状体DA含量的影响，结果表明甘松中剂量组对PD大鼠运动功能障碍的改善作用最佳，选择甘松中剂量进一步探究其抗PD机制。考察甘松对PD大鼠肠道胶质细胞、神经胶质细胞以及结肠和纹状体中神经递质的表达及含量的影响，结果表明甘松能够抑制PD大鼠肠道胶质细胞及神经胶质细胞的激活；抑制PD大鼠结肠和纹状体中DA、5-HT神经递质及其代谢产物含量下降的趋势，降低DA代谢速率。
综上所述，甘松抗PD的机制与抑制肠道胶质细胞和神经胶质细胞的激活，抑制肠道DA的分解，升高纹状体中DA及5-HT的含量有关，机制分析见图4，验证了甘松基于“脾胃学说”和“肠-脑轴”理论治疗PD的可行性。
4.1 甘松通过“肠-脑轴”改善PD大鼠运动功能障碍的分析
PD是以大脑中枢神经系统内DA能神经元的凋亡及α-突触核蛋白（α-synuclein，α-syn）的异常聚集为病理特征的神经系统退行性疾病，该病的患者会日渐产生严重的运动障碍[21]，另外有流行病学结果显示其患者在早期通常有明显胃肠道障碍[22]。2003年，Braak提出α-syn可能首先出现于肠道，随后以朊病毒的方式由肠自脑传播[23-24]，自此PD领域开展了对于“肠道起源”理论和微生物-肠-脑轴机制的研究。从改善胃肠道功能角度入手探索治疗PD也逐渐成为研究热点，肠和脑之间的双向信息交流也越来越受到关注。
甘松是我国传统中药材，中医理论认为其入脾、胃经，有“理气”“醒脾胃”之功。本课题组前期研究结果证明[16]，甘松不仅能抑制神经元退化，治疗PD，还能够恢复紊乱的肠道微生物群，减轻肠道炎症和神经炎症。因此本研究立足于中医“脾胃学说”，探讨甘松治疗PD，不仅符合传统中医药理论，也具有现代药理研究基础。
4.2 甘松通过抑制神经胶质细胞改善大鼠PD的机制分析
CNS中的神经胶质细胞包括星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞[25]。神经胶质细胞被过度激活会导致的CNS神经炎症，其发展进程主要受小胶质细胞影响，在某些情况下也会受星形胶质细胞和少突胶质细胞等大胶质细胞影响[26]。神经炎症在PD的病理发展过程中起到了极为关键的作用[27]，研究表明，CNS的神经炎症会促进DA能神经元细胞的凋亡和细胞自噬[28]。
小胶质细胞是CNS的常驻免疫细胞[29]，Iba-1是小胶质细胞的标志物。小胶质细胞能够介导及调节潜在有害的神经炎症反应[30]，发挥神经保护的作用[31]。研究发现，PD病人黑质中存在活化的小胶质细胞[32]。Sabogal-Guáqueta等[33]及Sironi等[34]发现，错误折叠的α-syn会激活中脑黑质致密部的小胶质细胞，使其分泌促炎因子，产生炎症和氧化应激。星形胶质细胞能够参与PD的神经病理过程[35-36]，星形胶质细胞标志物GFAP的表达增加是其被过度激活的标志[37]。星形胶质细胞过度激活后会产生极强的神经毒性，对突触的功能和CNS的可塑性造成损伤，破坏脑环境稳态[38]，进一步加重神经炎症和血脑屏障功能障碍，造成恶性循环状态。
综上所述，错误折叠的α-syn会引发CNS神经胶质细胞的过度激活，小胶质细胞分泌促炎因子的表达上升，导致神经炎症加重；过度激活的星形胶质细胞破坏脑环境稳态，进一步加重CNS神经炎症，进而引起DA能神经元的退化，在一定程度上加速PD的发生与发展过程。本研究结果表明，PD大鼠的纹状体中，出现了GFAP和Iba-1表达上升的现象，这种现象可能是由于星形胶质细胞和小胶质细胞被过度激活引起的[39]。而甘松给药后，抑制了神经胶质细胞的过度激活，制止了神经炎症的加重，从而发挥了抗PD作用。
4.3 甘松通过抑制肠道胶质细胞改善大鼠PD的机制分析
ENS通过交感神经中的迷走神经与CNS相连[40]，当ENS发生长期慢性炎症会导致血脑屏障受损，最终引起CNS中神经炎症的发生[41]。肠神经胶质细胞可能在PD患者产生的肠道炎症和神经炎症的发生和发展中起到重要作用[42]。GFAP是神经胶质细胞中星形胶质细胞的标志物，同时也是肠神经胶质细胞的一种广为人知的标志物[39]，Devos等[43]首先证明在PD病人的结肠活检中GFAP的表达水平有所提高，随后Clairembault等[44]的研究也发现GFAP在PD病人的胃肠道表达上升，这可能是由于肠神经胶质细胞被过度激活引起的[45]。此外有研究表明，肠道微生物群的存在对以Iba-1为标志物的小胶质细胞的发育成熟和功能发挥至关重要[46]。
肠神经胶质细胞和神经胶质细胞分别在启动肠道和大脑的先天免疫方面起着重要作用，与神经胶质细胞被过度激活后促进神经炎症的历程相同，肠神经胶质细胞被过度激活也可能会导致肠道炎症[47]。在PD患者的结肠中发现了出现功能障碍的肠神经胶质细胞和路易小体[48]，证明了当ENS中出现α-syn的异常集聚后，肠神经胶质细胞的表达随之上调[49]，进而可能会导致肠道神经元活性的改变以及肠道炎症的发生。
本研究结果表明，PD大鼠的结肠中，也出现了GFAP和Iba-1表达上升的现象，这可能是由于肠神经胶质细胞被过度激活引起的[39]。结合本课题组前期研究结果发现[16]，PD大鼠出现肠道微生物紊乱和肠道α-syn的错误折叠，使肠神经胶质细胞被过度激活，分泌促炎因子，导致肠道炎症的发生，α-syn随迷走神经扩散至脑，进一步激活神经胶质细胞导致CNS神经炎症，在PD中形成恶性循环[50]。甘松可以同时抑制肠道胶质细胞和神经胶质细胞的过度激活，制止这种恶性循环，起到抗PD的作用。
4.4 甘松通过神经递质改善大鼠PD的机制分析
脑和肠道关系密切，二者均起源于早期胚胎的神经嵴[51]，肠-脑轴作为双向交流系统，使得神经递质对PD病人的非运动症状有着重要影响[52]。其中DA和5-HT及其代谢产物HVA、DOPAC、5-HIAA含量的变化是PD临床诊断的主要指标之一[53]。
DA是负责调节平衡和运动的重要神经递质[54]，PD发生后纹状体中DA的进行性下降是引起运动症状的主要原因，DA信号通路被认为与PD机制相关或可用于相关治疗。研究表明，PD患者结肠平滑肌层的DA含量低于正常人[55]，这表明肠多巴胺能系统的损害是导致PD病人出现胃肠道功能失调的一个重要因素。而HVA和DOPAC是DA的中间产物和最终产物，游离的HVA和DOPAC具有神经毒性，其可加重神经元细胞损伤[56]。
5-HT是中枢神经系统调节情绪水平的关键神经递质和信号分子，与胃肠道功能相关，研究表明，肠道微生物可以通过控制色氨酸通路对机体的新陈代谢过程进行调节，促进5-HT代谢物5-HIAA的产生，从而抑制5-HT的合成[57]。因此，神经递质及其代谢产物的变化可能与PD患者出现的早期胃肠道功能障碍、胃动力不足等症状密切相关。
本研究考察了PD大鼠结肠及纹状体中神经递质及其代谢产物含量的变化，结果表明PD大鼠结肠及纹状体中DA及5-HT的代谢过程速率远高于合成速率，而甘松醇提物能有效抑制神经递质含量的减少和代谢分解过程，起到治疗PD的作用。这也提示PD患者早期的胃肠道障碍除了与Braak提出的“dual hit”假说有关以外[24]，也可能与神经递质含量的改变有一定相关性。
综上，本研究证明了甘松能够抑制ENS中过度激活的肠道胶质细胞及CNS中因α-syn错误折叠而过度激活的神经胶质细胞，并抑制DA及5-HT等神经递质的代谢过程从而提高其含量，通过肠–脑轴发挥抗PD作用。PD作为世界范围内的疾病难题，其发病机制极为复杂。本研究在传统中医理论“脾胃学说”和现代医学“肠-脑轴”理论的共同指导下，探讨甘松对PD模型大鼠行为的改善作用，可为入脾胃经中药的抗PD的研究提供新思路。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：薛静文，万国慧，李佳园，魏晓嘉，于佳禾，杨 雪，刘朦朦， 芦艺凡，范文昕，张 鸽，石晋丽． 基于肠-脑轴理论探讨甘松对帕金森大鼠运动功能障碍的改善作用及机制 [J]. 中草药, 2023, 54(9):2822-2831.
转自：“如沐风科研”微信公众号
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