论文ID
原名：Fufang Shengdi mixture alleviates psoriasis-like skin inflammation via promoting Annexin-A proteins expression
译名：复方生地合剂通过促进膜联蛋白-A蛋白表达缓解银屑病样皮肤炎症
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.195
发表时间：2023.03
通讯作者：杨杨 & 张彤
通讯作者单位：上海中医药大学科技实验中心
实验设计
实验结果
1. FFSD的化学成分
我们通过UPLC-HRMS对FFSD样品进行分析，并根据样品的多级质谱信息和天然产物高分辨率质谱数据库及相关文献鉴定出109种非极性化合物。总离子色谱图如图1 A–B所示（表S2中列出了相关化合物）。
图1 UPLC-HRMS检测在负离子模式（A）和正离子模式（B）下FFSD的总离子色谱图
2. FFSD可减轻咪喹莫特诱导的小鼠银屑病症状
IMQ是Toll样受体的配体，它能强烈激活免疫系统。IMQ可引起小鼠的银屑病症状，如红斑、鳞屑、echinoderma角化病、角化不全症和皮肤免疫细胞浸润。IMQ诱导的小鼠已成为最近广泛使用的银屑病动物模型。IMQ诱导的小鼠的PASI评分显著高于未试验过的老鼠（Naive mice，野生小鼠），而FFSD组的评分显著低于模型对照组（图2A）。模型对照组小鼠出现皮肤红斑、鳞屑和皮肤增厚症状。在FFSD组中，红斑和鳞屑减少，皮肤增厚减少（图2B）。在图2C中，黑色箭头表示角化不足；绿色箭头表示角化过度；红色箭头表示小脓肿；蓝色箭头斑秃；黄色箭头表示炎症细胞浸润；白色箭头表示毛细血管扩张。H&E染色显示IMQ诱导的小鼠有严重的皮肤损伤，给予FFSD的小鼠有较小程度的皮肤损伤（图2C）。H&E染色的“损伤评分（break score）”显示，模型对照组的小脓肿、角化过度、角化不全、斑秃、炎症细胞浸润和毛细血管扩张评分较高，而接受FFSD处理的小鼠的病理评分略低（图2D）。FFSD还可以缓解IMQ引起的表皮增厚（图2E）。此外，FFSD还降低了IMQ诱导的脾脏质量指数（图2F）以及血清中γ干扰素（IFN-γ）和肿瘤坏死因子（TNF-α）的含量（图2G）。上述结果表明，FFSD在治疗IMQ诱导的小鼠银屑病中是有效的，并且是免疫抑制的。
图2 FFSD可减轻咪喹莫特诱导的小鼠银屑病症状
（A）银屑病区域严重程度指数（PASI）评分。（B）第7天小鼠的背部形态。（C）皮肤活检用苏木精和伊红染色（H&E，× 20）。比例尺= 100 μm。（D）break得分（n = 6）。（E）背部表皮厚度的量化（n = 6）。（F）各组脾脏指数。（G）ELISA法检测各组外周血TNF-α和IFN-γ水平。与Naïve（野生小鼠对照）组相比，# p < 0.05，## p < 0.01，### p < 0.001。与模型对照组相比，*p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。
3. FFSD的免疫抑制活性
IMQ诱导的小鼠银屑病模型是一种急性诱导模型，在小鼠中诱导急性局部皮肤炎症。然而，银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，炎症细胞和细胞因子可以在全身各个器官循环，并会影响每个器官的系统功能障碍。因此，IMQ诱导的小鼠不能完全模拟慢性银屑病患者的长期炎症和整体免疫失调状态。我们利用本实验诱导的OVA系统免疫模型，探讨FFSD的免疫抑制作用及其机制。OVA是蛋清的主要蛋白质成分，其分子量约为45 kD。OVA注射到小鼠体内后会刺激小鼠的免疫系统，导致免疫功能亢进。OVA诱导的小鼠是T细胞介导的免疫反应的经典动物模型。OVA刺激Th1细胞产生的IFN-γ激活巨噬细胞，随后通过分泌促炎介质（如TNF-α）触发免疫反应。OVA诱导的小鼠具有与IMQ诱导的小鼠相似的机制，这也可以补偿IMQ模型的短实验周期和局部免疫反应。因此，我们在本实验中使用OVA诱导的小鼠作为补充模型。
细胞增殖测定结果显示，OVA诱导的模型对照组中全脾细胞的增殖能力显著高于初始（Naive）组，而FFSD组则趋于减弱（图3A）。ELISA结果显示，FFSD可显著降低OVA诱导小鼠血浆中抗OVA抗体和免疫效应细胞因子（如IFN-γ和TNF-α）的水平（图3 B-C），表明其在OVA诱导的小鼠中具有免疫抑制作用。
我们还通过流式细胞术检测了小鼠外周血单核细胞（PBMC）中细胞的比例。如图2D所示，与对照组相比，FFSD降低了非特异性免疫细胞（CD4− IFN-γ+）的比例，显示出Th1细胞（CD4+和IFN-γ+）比例降低的趋势。然而，FFSD对Th17细胞（CD4+ IL-17 A+）没有显著影响 的作用，并且FFSD在Treg细胞（CD4+ Foxp3+CD25+）上没有显示出显著差异，但是仍有降低百分比的趋势（图3E-F）。上述结果表明，FFSD具有免疫抑制的药理作用，可能与Th1型相关免疫反应有关。
图3 FFSD的免疫抑制活性
（A）整个脾脏细胞的增殖能力。（B和C）通过ELISA测定各组外周血总免疫球蛋白（IgG）、TNF-α和IFN-γ水平。（D–F）通过流式细胞术检测PBMC中IFN-γ+ CD4-、IFN-γ+ CD4+、CD4+ IL-17+和CD4+ CD25+Foxp3+细胞的表达。与Naive组相比，# p < 0.05，## p < 0.01，### p < 0.001。与对照组相比，*p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。
4. FFSD免疫抑制效应蛋白组表达的变化
我们通过蛋白质组学定量分析，共鉴定出3959种蛋白质。根据差异蛋白（DEPs）标准，其倍数变化大于等于1.3且p < 0.05。与模型对照组相比，初始小鼠组中有174个上调蛋白和48个下调蛋白（图4 A）。我们对这些蛋白质进行了基因本体（GO）分析，包括生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）。结果表明，上述DEPs主要与T细胞抗原处理和呈递、参与炎症反应的白细胞迁移、MHC II类蛋白复合物和CD4受体结合有关（图4 B）。在模型对照组与FFSD组中，我们发现29种上调蛋白和91种下调蛋白（图4 C）。GO分析结果表明，上述DEPs主要与囊泡融合、核内体膜的外源性成分和S100蛋白结合的正调控有关（图4 D）。有趣的是，通过热图聚类分析，我们发现所有GO富集的蛋白质在FFSD的作用下上调（图4 E）。这些蛋白质的相互作用关系是从String数据库中获得的。根据蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析，AANXAs的ANXA1、ANXA2、ANXA5、ANXA11和S100a11可能在FFSD治疗银屑病中发挥主要调节作用（图4F）。
图4 FFSD免疫抑制效应蛋白质组表达的变化
（A）初始小鼠组与对照小鼠组DEPs的火山图。蓝点表示下调的蛋白质，红点表示上调的蛋白质，灰点表示FFSD组与IMQ组之间没有统计学显著差异的蛋白质。（B）初始小鼠组与模型对照组下调蛋白的GO分析。（C）对照组与FFSD组的DEPs火山图。（D）对照组与FFSD组上调蛋白的GO分析。（E）对照组与FFSD组之间的DEPs热图。（F）对照组与FFSD组之间DEPs的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析。
5. FFSD对IMQ诱导小鼠ANXAs表达的影响
蛋白质组学预测的证据表明ANXA家族对抑制炎症反应很重要。我们进行实时荧光定量PCR（qPCR）测定以验证ANXA家族mRNA的转录。在IMQ诱导的模型对照组中，Anxa1、Anxa2和S100a11的相对mRNA转录水平显著低于初始小鼠组。接受FFSD处理后，与模型对照组相比，这些因子的相对mRNA转录水平显著上调，其中Anxa1 mRNA的上调最为显著（图5A）。
图5 FFSD对银屑病小鼠中IMQ诱导的小鼠ANXA表达的影响
（A）通过qPCR分析ANXA家族的mRNA表达水平。（B）背部皮肤病变表皮中ANXA1染色（棕色）的代表性图像（100 ×）（n = 6）。（C）背部皮肤中ANXA1表达的定量（n = 6）。与初始野生小鼠组相比，#p < 0.05，## p < 0.01，###p < 0.001。与对照组相比，*p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001。
此外，我们检测了ANXA1在小鼠皮肤中的表达，如图5 B所示。定量结果如图5C所示，与IMQ诱导的对照小鼠相比，在FFSD处理的小鼠的皮肤中，ANXA1显著增加，尤其是在浸润的炎症细胞中。因此，与蛋白质组学分析结果一致，FFSD可以显著上调银屑病病变中ANXAs的表达水平。
讨论
银屑病是一种免疫介导的慢性皮肤病。银屑病的发病机制复杂，涉及免疫、遗传和环境因素，其中免疫因素在疾病的发生和发展中起着至关重要的作用。银屑病患者的皮肤有密集的免疫细胞浸润，包括T细胞、树突状细胞、自然杀伤T细胞和巨噬细胞。自从Fitch和Kastelein发现了银屑病发病机制的“IL-23 / Th17通路”理论以来，许多作者已经研究了IL-23/Th17-通路在银屑病中的作用。随后，一系列单克隆抗体被开发出来用于治疗银屑病。例如，抗IL-23、IL-12、IL-23（p40）和IL-17的单克隆抗体对治疗中度至重度银屑病有效。虽然靶向疗法不断改进，其安全性和有效性得到了保证，但是由于价格高、耐受性强和副作用，它们仍然没有被广泛使用。到目前为止，银屑病仍然是一种无法治愈的疾病。我们希望能够开发出治疗银屑病的新药，同时减轻患者的痛苦和经济负担。中草药（CHM）是补充医学和替代医学的组成部分，在治疗银屑病方面有着悠久的历史。中药结构多样，不良反应少，越来越多的天然产物在各种疾病中显示出巨大的治疗潜力。CHM的特点是疾病与证据相结合、循证治疗、整体治疗和分期治疗。中医药可以通过多靶点、多途径治疗银屑病，具有其他不可忽视或替代的治疗优势。
银屑病是一种由过度免疫引起的自身免疫性疾病。我们的研究表明，FFSD通过促进ANXAs的表达来发挥免疫抑制作用。ANXAs是一个钙依赖性磷脂结合蛋白家族。根据进化关系，ANXA在脊椎动物细胞中表达。目前研究者们已发现12名家族成员，分别命名为ANXA1-11和ANXA13。在我们之前的研究中，我们发现在FFSD的作用下，ANXA1、2、5、6和11的表达水平显著增加。近年来，大量研究报道了ANXAs的免疫调节机制，其主要作用是免疫抑制。研究表明，ANXA1在巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞中高表达，在T淋巴细胞、肥大细胞和B细胞亚群中仅最低表达。ANXA1被认为是一种内源性抗炎分子，具有抑制先天免疫反应的作用。例如，阻断环氧合酶-2（COX2）表达、降低诱导型一氧化氮合酶（iNOS）水平和抑制前列腺素合成的作用已在巨噬细胞中得到证实。ANXA1还可以促进巨噬细胞分化为M2型细胞，并增加M2型细胞中白细胞介素-10（IL-10）的表达。此外，ANXA1还减少树突状细胞（DC）上促炎Toll样受体的激活和TNF的分泌。在获得性免疫的研究中，因为Th17细胞的增殖和激活不受控制 ，并产生高水平的Th17细胞相关细胞因子，ANXA1 −/−小鼠表现出显著增强的视网膜炎症和病理。同样，自身免疫性疾病葡萄膜炎患者中，ANXA1缺失与Th17 细胞的增殖和激活有关。在癌症研究中，ANXA1可以增强Treg细胞的功能，这也表明了ANXA1的免疫抑制调节作用。ANXA1基于自身免疫性疾病的治疗，如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和多发性硬化症，由于其免疫抑制和抗炎作用，也被视为潜在的治疗靶点。然而，到目前为止，除了ANXA6基因多态性与甲氨蝶呤（MTX）治疗银屑病的疗效相关的报道外，几乎没有关于ANXAs在银屑病中的报道。通过这项研究，我们可能会初步揭示ANXAs与银屑病治疗之间的关系。
作为钙依赖性磷脂结合蛋白，ANXAs以钙依赖的方式被激活，几乎所有的生物过程都受到Ca2+浓度的调节。在没有钙离子（Ca2+）的情况下，ANXA1的N-末端保持靠近膜磷脂结构域，而在Ca2+存在下，ANXA1发生构象变化，使其能够通过C末端区域与磷脂结合，并暴露出N末端结构，从而发挥生物作用。有趣的是，FFSD的成分中含有中药“生石膏”，其主要成分是水合硫酸钙（CaSO4·2H2O），也被报道与抗炎和免疫抑制有关。生石膏能否通过维持体内Ca2+水平（如血钙浓度）来确保ANXAs的免疫调节功能，还需要进一步研究。此外，FFSD在促进ANXA1表达方面的新发现会起什么作用？我们将继续研究，以进一步阐明银屑病中FFSD的机制。
结论
本研究表明，FFSD可以改善IMQ诱导的小鼠银屑病的药理作用，并发现FFSD的免疫抑制药理作用可能与增加ANXAs的表达有关。它对CHM免疫调节的药理学作用和ANXAs在银屑病发病机制和治疗中的调节作用具有提示作用。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36940737/
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