流行性感冒（简称流感）是一种由流感病毒引起的急性呼吸道疾病，以具有高度传染性、传播性和易于变异的甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）为主[1-3]。每年因IAV引起的呼吸道疾病死亡的人数多达65万例，对社会经济和人类健康造成了巨大的负担。肺作为气体交换的主要器官，含有先天性和适应性免疫细胞，当机体感染IAV时能够诱导强大的免疫反应[4]。肺上皮细胞作为肺泡中病原体防御的第一道防线，是肺损伤过程中被损伤的初始部位[5]，也是成为推动肺部疾病进展的一大动力。肺泡巨噬细胞（alveolar macrophage，AMΦ）位于肺实质内，是肺组织中的主要免疫细胞，在病毒清除和免疫调节中扮演着关键角色。并且与肺上皮细胞相比，在IAV感染期间AMΦ的感染效率很低，AMΦ会向M1型极化转化，促进炎症细胞因子的分泌，导致肺组织中性粒细胞浸润和组织损伤[6]。外泌体是一种由宿主细胞分泌的细胞外囊泡，因其在机体生理病理活动中的细胞通讯作用日益被关注。本课题组前期研究发现，IAV可以引起肺上皮细胞源外泌体miRNA差异表达，通过外泌体miR-1249-5p靶向调节溶质载体家族4成员A1（solute carrier family 4 member 1，SLC4A1）基因抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路，从而参与肺炎和功能障碍的过程[7-8]。
麻杏石甘汤出自中医经典著作《伤寒论》，由麻黄、杏仁、石膏和甘草4味药组成，有辛凉宣泄、清肺平喘之功效，广泛用于流感性感冒之风寒郁而化热或外感风热的治疗，联合化学药可治疗支原体肺炎[9]。课题组前期研究表明麻杏石甘汤能够通过调节细胞因子的分泌、调控炎性相关信号传导途径、抑制IAV诱导的损伤效应，发挥抗IAV的作用[10-11]，基于前期研究，采用麻杏石甘汤治疗后的肺上皮细胞源外泌体，赋予肺上皮细胞源外泌体药物治疗功能，探讨功能性外泌体调控巨噬细胞极化以及对麻杏石甘汤抗IAV的作用机制。
1 材料
1.1细胞、病毒株和动物
小鼠肺上皮MLE-12细胞为本实验室传代保存，RAW246.7肺泡巨噬细胞株来自中科院细胞库。
流感病毒小鼠肺适应株（A型，IAV，A/PR/8/34）为湖南师范大学病毒研究室惠赠。经10日龄鸡胚尿囊腔接种培养传代，血凝效价1∶640以上者供实验用。将病毒尿囊液以灭菌生理盐水稀释成每0.1毫升50 LD50[感染复数（multiplicity of infection，MOI＝0.1）]置于冰袋中备用。
1.2动物
SPF级雄性SD大鼠24只，6～8周龄，体质量220～250 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，质量合格证号ZS-202110120005。动物饲养于湖南中医药大学动物实验中心，动物实验经湖南中医药大学动物实验中心伦理委员会批准（批准号LL2021101202）。
1.3药材
麻杏石甘汤由麻黄9 g（批号2004060）、杏仁9 g（批号2020120302）、石膏18g（批号2008090062）和炙甘草6 g（批号201003）组成，以上药材均购自湖南中医药大学第一附属医院，由湖南中医药大学药学院戴冰教授鉴定分别为麻黄科植物麻黄Ephedra intermedia Schrenk et C. A. Mey.的干燥草质茎、蔷薇科植物山杏Prunus armeniaca L. var. ansu Maxim.的干燥成熟种子、硫酸盐类矿物石膏族石膏、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根茎，均符合《中国药典》2020年版规定。
1.4药品与试剂
RPMI 1640基础培养液（批号WF0021F221）、DMEM基础培养液（批号WH0021D031）、无外泌体培养液（批号PB180438）、PBS（批号WH0021D081）、无血清非程序冻存液（批号WH0021A081）、双抗（批号WH1021A161）均购自武汉普诺赛生命科技有限公司；胎牛血清（批号SA210518）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；病毒稀释液[含RPMI 1640基础培养液、1 mol/L HEPES（批号WH01111711SP）、1 mg/mL TPCK-Try、NaHCO3、双抗]、病毒维持液（含0.2%胎牛血清的病毒稀释液）、磷酸奥司他韦（批号HY-17016）购自MCE公司；CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒（批号BS350A）购自Biosharp公司；miRNA逆转录引物购自上海生工生物工程有限公司；白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）抗体（批号DF6087）购自Affinity公司；IL-1β抗体（批号ab79559）购自英国Abcam公司；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗体（批号17590-1-AP）购自Proteintech公司；NF-κB抗体（批号bs-0465R）、β-actin抗体（批号AG07197903）购自BIOSS公司；SLC4A1抗体（批号23276S）购自美国CST公司；二抗（批号E-AB-1003）购自Elabscience公司。
1.5仪器
流式细胞仪、Optima MAX-XP型台式超速离心机（美国Beckman Coulter公司）；3111型CO2细胞培养箱（美国Thermo公司）；Western blotting工作系统、CFX Touch荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）；ELX800型酶标仪（美国Bio-Tek公司）；NS300型马尔文纳米颗粒跟踪分析仪（英国马尔文仪器公司）。
2 方法
2.1麻杏石甘汤含药血清的制备
2.1.1 麻杏石甘汤水煎剂的制备 根据《方剂学》中麻杏石甘汤的药物组成、剂量及煎煮方法制备水煎剂，按动物体表面积剂量换算法，根据《方剂学》和《中药药理学》，采用表面积剂量换算法，制备5倍临床等效剂量的麻杏石甘汤煎剂。按照中药比例称取1剂的药材量，加入10倍体积蒸馏水浸泡20 min，武火煮沸后文火煎煮30 min，煎煮后滤过，二煎加入7倍体积蒸馏水，同样方式煎煮完毕后，合并2次滤过液，水浴浓缩至含生药3.8 g/mL。
2.1.2 含药血清的制备 SD大鼠随机分为对照组和麻杏石甘汤组，每组10只。麻杏石甘汤组ig药物，对照组ig等体积蒸馏水，1次/d，每次4 mL，连续7 d，在末次给药2 h后对大鼠进行麻醉固定，腹主动脉采血，在4℃冰箱内静置2 h，3000 r/min离心10 min，收集血清，得到麻杏石甘汤含药血清和空白对照血清，同组血清混合后56℃灭活，用0.22 μm微孔滤膜滤过除菌后分装，−20℃保存备用。通过超高液相色谱法检测麻杏石甘汤含药血清中的麻黄碱和甘草酸的质量浓度分别为0.592、0.276 mg/mL。
2.2细胞培养
MLE-12和RAW246.7细胞用10%胎牛血清、1%双抗、90%基础培养液，于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，每天更换细胞培养液，当细胞生长至培养瓶90%时，用0.25%胰蛋白酶进行消化、传代。
2.3CCK-8检测细胞活性
2.3.1 麻杏石甘汤含药血清对正常肺上皮细胞活性的影响 MLE-12细胞以4000个/孔接种至96孔板，分别用80%、40%、20%、10%的麻杏石甘汤含药血清以及空白血清干预24 h。加入CCK-8试剂，测定450 nm波长处的吸光度（A）值，计算细胞抑制率。
细胞抑制率＝1－A实验/A对照
2.3.2 麻杏石甘汤含药血清对IAV感染的肺上皮细胞活性的影响 MLE-12细胞以4000个/孔接种至96孔板，以IAV干预细胞2 h，再分别用80%、40%、20%、10%的麻杏石甘汤含药血清以及空白血清干预8 h。加入CCK-8试剂，测定450 nm波长处的A值，计算细胞存活率。
细胞存活率＝A实验/A对照
2.4 功能性外泌体的获取
将MLE-12细胞设置对照组、模型组及麻杏石甘汤含药血清低、高剂量（10%、20%）组和奥司他韦（5 μmol/mL）组，待细胞长至90%时，在IAV刺激2 h后，对照组和模型组加入空白含药血清，各给药组加入相应药物。处理8 h后，收集各组细胞上清液，通过差速超高速离心提取物为功能性外泌体样本。
2.5 纳米颗粒跟踪分析
将获取的各组功能性外泌体沉淀加入1 mL PBS重悬混匀后，在比色皿中加入0.2 mL外泌体悬液，使用BT-Zeta100纳米粒度及Zeta电位分析仪，通过Origin 2021软件分析实验数据。
2.6BCA检测外泌体浓度
将获取的各组功能性外泌体加入1 mL PBS重悬，根据BCA试剂盒说明书，在96孔板中每孔加入20 μL悬液，每组3个复孔，加入BCA工作液，37 ℃孵育30 min，检测562 nm波长处的A值，计算各组功能性外泌体浓度。
2.7功能性外泌体与巨噬细胞共培养
将巨噬细胞以1×106个/孔接种至6孔板中，待细胞贴壁后，取“2.4”项下收集的肺上皮细胞源外泌体加入1 mL基础培养液重悬，将各组功能性外泌体分别与巨噬细胞共培养24 h，250 μL/孔，设置对照组（EVs-Con）、模型组（EVs-Model）、麻杏石甘汤含药血清低剂量组（EVs-LD）、麻杏石甘汤含药血清高剂量组（EVs-HD）、奥司他韦组（EVs-OS），于24 h后收集巨噬细胞，待后续检测。
2.8qRT-PCR检测功能性外泌体miR-1249-5p mRNA及巨噬细胞miR-1249-5p、SLC4A1、NF-κB、IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β1mRNA表达
取“2.4”项下提取的功能性外泌体，按照试剂盒说明书提取外泌体中总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析，检测外泌体miR-1249-5p基因表达水平。
按“2.7”项下方法处理细胞，收集各组巨噬细胞，预冷的PBS清洗2遍，按照试剂盒说明书提取巨噬细胞中总RNA并合成cDNA，进行qRT-qPCR分析，检测巨噬细胞中miR-1249-5p、SLC4A1、NF-κB、IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β1基因表达水平。引物序列见表1。
2.9 Western blotting检测巨噬细胞SLC4A1、NF-κB、IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白表达
按“2.7”项下方法处理细胞，收集各组巨噬细胞，加入RIPA裂解液提取总蛋白，用BCA试剂盒检测总蛋白浓度，高温变性后蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，用1×TBST洗涤，加入5%牛血清白蛋白，37 ℃封闭2 h，用1×TBST洗涤，加入一抗，4 ℃孵育过夜，用1×TBST洗涤，加入二抗，室温孵育2 h。ECL显影曝光后采用化学发光仪检测并分析。
2.10 流式细胞术检测巨噬细胞M1/M2分型
按“2.7”项下方法处理细胞，收集各组巨噬细胞，用预冷的PBS清洗2遍，制备成5×106个/mL的细胞悬液，采用流式细胞仪检测巨噬细胞M1/M2分型。
2.11 统计学分析
运用SPSS 21.0统计软件进行处理数据，计量资料经检验符合正态分布，方差齐性，以表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用One-way ANOVA检测。
3结果
3.1 麻杏石甘汤含药血清对正常肺上皮细胞活性的影响
如表2所示，与对照组比较，80%、40%麻杏石甘汤含药血清干预后，肺上皮细胞活性均显著降低（P＜0.05、0.01），20%、10%的含药血清组对肺上皮细胞活性无明显影响。
3.2麻杏石甘汤含药血清对IAV感染的肺上皮细胞活性的影响
如表3所示，与对照组比较，模型组肺上皮细胞活性显著下降（P＜0.001）；与模型组比较，10%、20%、40%含药血清组细胞活性明显增加（P＜0.05、0.01、0.001），80%的含药血清抑制细胞增殖。综合以上2个实验结果，选取20%和10%的含药血清进行后续实验。
3.3功能性外泌体鉴定
使用纳米颗粒追踪分析技术确定外泌体大小，如图1所示，外泌体大小均一，粒径均为50～100 nm，无明显差异。BCA法对各组功能性外泌体总蛋白浓度进行检测，结果见图2，表明不同干预因素会影响外泌体的分泌，所以后续实验决定采用同体积的外泌体干预巨噬细胞。
3.4功能性外泌体中miR-1249-5p基因表达
如图3所示，与对照组比较，模型组外泌体miR-1249-5p mRNA表达水平显著下降（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组外泌体miR-1249-5p mRNA表达水平明显增加（P＜0.05、0.001），而含药血清低剂量组miR-1249-5p mRNA表达水平高于含药血清高剂量组和奥司他韦组。
3.5 功能性外泌体对巨噬细胞miR-1249-5p基因表达的影响
如图4所示，与EVs-Con组比较，EVs-Model组巨噬细胞miR-1249-5p mRNA表达水平显著降低（P＜0.001）；与EVs-Model组比较，各给药组巨噬细胞miR-1249-5p mRNA表达水平明显增加（P＜0.05、0.001），EVs-LD组miR-1249-5p mRNA表达水平高于EVs-HD和EVs-OS组。
3.6功能性外泌体对巨噬细胞SLC4A1、NF-κB、IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表达的影响
如图5所示，与EVs-Con组比较，EVs-Model组巨噬细胞中SLC4A1、NF-κB、IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表达水平均显著升高（P＜0.01、0.001）；与EVs-Model组比较，各给药组巨噬细胞中SLC4A1、IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表达水平均显著降低（P＜0.05、0.01、0.001），EVs-HD组、EVs-OS组巨噬细胞中NF-κB mRNA表达水平显著降低（P＜0.05、0.01）。
3.7功能性外泌体对巨噬细胞SLC4A1、NF-κB、IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白表达的影响
如图6所示，与EVs-Con组比较，EVs-Model组巨噬细胞中SLC4A1、NF-κB、IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01）；与EVs-Model组比较，各给药组巨噬细胞中以上蛋白表达水平均显著降低（P＜0.01）。
3.8功能性外泌体对巨噬细胞M1/M2表型极化的影响
如图7所示，与EVs-Con组比较，EVs-Model组巨噬细胞CD86+的比例显著升高（P＜0.01）；与EVs-Model组比较，各给药组巨噬细胞CD86+细胞比例明显下降（P＜0.05）。
3.9 功能性外泌体对巨噬细胞M1/M2表型基因表达的影响
如图8-A所示，与EVs-Con组比较，EVs-Model组巨噬细胞M1极化表型相关因子TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达水平均明显升高（P＜0.01、0.001），M2极化表型相关因子IL-10和TGF-β1 mRNA表达水平明显降低（P＜0.05、0.01）；与EVs-Model组比较，各给药组TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达水平均明显降低（P＜0.05、0.01、0.001），M2极化表型相关因子TGF-β1 mRNA表达水平明显升高（P＜0.05、0.01、0001），EVs-HD组、EVs-OS组M2极化表型相关因子IL-10 mRNA表达水平明显升高（P＜0.05、0.01），EVs-LD组IL-10 mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）。
4 讨论
流感每年都会引发人类呼吸道疾病，对社会经济和人类健康造成了巨大的负担，且IAV传播速度快及病毒易于变异，因此对流感的预防和控制越来越困难[12]。研究表明，miRNA在病毒对宿主细胞的影响中发挥着重要作用[13-14]。而外泌体作为细胞间物质递送的信使，在IAV感染期间，感染细胞释放的外泌体即可以通过携带病毒或宿主miRNA参与细胞之间释放和交换信息，调节宿主免疫应答进而增加病毒复制，激活和调节抗病毒反应[15]。此外，细胞外泌体可以诱导肺部炎症和促进肺泡巨噬细胞活化，增加巨噬细胞的吞噬功能以消除病原体，选择性激活M2巨噬细胞抑制炎症反应，减缓肺部炎症[16-18]。
本课题组前期研究表明，IAV可以诱导肺上皮细胞源外泌体miRNA的差异表达[7]。本研究通过对外泌体的鉴定证实，不同干预方式下外泌体的大小无明显变化，但外泌体的分泌会有差异。同时流感病毒诱导的肺上皮源外泌体miR-1249-5p的表达明显下降，而麻杏石甘汤组外泌体miR-1249-5p表达水平明显增加。当用不同干预方式获取的肺上皮源外泌体（即功能性外泌体）与巨噬细胞共培养后，各组巨噬细胞miR-1249-5p表达与外泌体miR-1249-5p表达相一致，这提示了肺上皮细胞可能通过分泌包裹miR-1249-5p的外泌体至巨噬细胞内，从而影响巨噬细胞的炎症反应。此外，课题组前期研究发现，IAV干预后肺上皮细胞源外泌体miR-1249-5p可以靶向调节SLC4A1基因抑制NF-κB信号通路调节炎症[8]，因此，本研究通过qRT-PCR和Western blotting检测了SLC4A1和NF-κB信号通路的相关因子，麻杏石甘汤能够明显降低SLC4A1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β的表达，提示麻杏石甘汤可以增加外泌体miR-1249-5p的表达，下调SLC4A1的表达，进而抑制NF-κB信号通路。与此同时也发现，功能性外泌体与巨噬细胞共培养后，模型组外泌体干预后的巨噬细胞CD86+的比例明显升高，TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA的表达增加，IL-10、TGF-β1 mRNA的的表达降低，麻杏石甘汤组外泌体能够逆转这一趋势，表明麻杏石甘汤可以借助外泌体抑制巨噬细胞M1型极化，从而减缓炎症细胞浸润导致的急性肺损伤。
综上，麻杏石甘汤可能通过肺上皮细胞源外泌体递送miR-1249-5p到巨噬细胞中，并靶向巨噬细胞中SLC4A1调控NF-κB信号通路，抑制流感病毒的细胞级联损伤效应的作用机制。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：马心悦，黄家望，冯芷莹，刘卓琳，王康宇，卢芳国，朱梦晨，李 玲．麻杏石甘汤通过外泌体miR-1249-5p靶向SLC4A1抑制流感病毒细胞级联损伤效应研究 [J]. 中草药, 2023, 54(9):2832-2840.
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