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题目：Co-opting signalling molecules enables logic-gated control of CAR T cells
期刊：Nature
IF：69.504
发表时间：2023年3月8日
通讯作者单位：斯坦福大学
DOI：https://doi.org/10.1038/s41586-023-05778-2
主要内容：
由于缺乏肿瘤特异性表面抗原，限制了CAR T细胞在实体瘤中的应用。一种新的AND-门控CAR T细胞系统重新利用了近端T细胞信号蛋白，将激活限制在双抗原相遇的情况下，在临床前模型中减轻了靶向、非肿瘤的毒性，同时保留了抗肿瘤的功效。
嵌合抗原受体（CAR）T细胞已成为某些血液肿瘤的强大治疗方式，导致美国食品和药物管理局（FDA）批准了六个CAR产品。然而，它们在实体瘤中的成功应用受到了一些因素的阻碍，包括（但不限于）专属肿瘤抗原的匮乏。Tousley等人描述了一种双靶向CAR T细胞系统，该系统使用近端信号分子与膜结合的抗原结合域（如单链可变片段（scFvs））融合，以确保T细胞只在两种目标抗原存在的情况下激活。这种逻辑门细胞内网络（LINK）CAR系统显示了改进的AND门控制，表明它可以提供高度特异的治疗活性，并扩大CAR疗法的可靶向抗原和疾病的范围。
迄今为止，最常用的CAR产品是第二代CAR，它结合了细胞内CD3z链（"信号1"）和CD28或4-1BB共刺激内模（"信号2"），在受体参与后诱导T细胞激活和扩增。这些针对CD19的第二代CAR T细胞--一种仅限于B细胞系的表面分子，被大多数B细胞恶性肿瘤广泛和高度表达--是第一个获得FDA批准的CAR产品。尽管B细胞增生是一种预测的、临床上可控制的CD19特异性CAR T细胞的靶向、非肿瘤效应，但在实体瘤上高而均匀地表达而在重要组织上不表达的靶点是罕见的。目标抗原在健康组织上的表达会带来严重的、威胁生命的副作用的风险；因此，肿瘤专用抗原的匮乏导致CAR疗法在实体瘤上的治疗成功有限。这一障碍鼓励了人们努力识别新型的、真正的肿瘤特异性抗原，并激发了应用布尔逻辑门设计CAR T细胞以实现选择性肿瘤靶向的策略。
在这种情况下，人们开发了带有AND门控CAR系统的双靶向策略，以提高特异性和安全性，因为T细胞完全激活需要结合两种抗原。以前描述的AND门控CAR系统包括分裂信号策略，其中T细胞共同表达第一代CAR（信号1）和提供共刺激的嵌合共刺激受体（CCR）（信号2），每个都有不同的特异性。与表达这两种抗原的肿瘤结合可促使T细胞完全激活，而与单一抗原结合只能诱发次优的T细胞激活。这种策略减少了对单独表达两种抗原的健康组织的活性；然而，如果不仔细平衡CAR的活性，基于CD3z的CAR仍可能对单一阳性组织表现出泄漏性活性。最近的一种策略是使用合成的NOTCH（synNotch）受体，在遇到第一种抗原后导致转录因子的释放，从而诱导同一肿瘤上第二种抗原特异性的常规CAR的表达。虽然这种基因回路提供了一个减少副作用的步骤，但肿瘤外的毒性可能发生在表达CAR同源目标的相邻健康组织中。其他和门方法涉及蛋白质开关，如分裂、通用和可编程（SUPRA）CAR，由具有白氨酸拉链胞外结构的zipCAR T细胞和肿瘤靶向scFv适配体（zipFv）组成，或共定位依赖的蛋白质开关（Co-LOCKR），在与确定的细胞表面抗原组合结合后被激活。然而，这种蛋白开关的药代动力学和生物分布具有挑战性，效应细胞和靶细胞的突触形成将需要优化，一些人工成分可能会诱发免疫原性，这可能会限制T细胞的持久性。这表明，尽管每个系统都取得了改进，但仍存在一些局限性，真正安全、特异和高效的逻辑门控CAR方法的开发仍然遥遥无期。
为了填补这一空白，Tousley等人利用T细胞信号传导所需的LAT和SLP-76支架域，设计了他们所谓的LINK CARs，直接将T细胞活性限制在两个抗原的结合上（图1）。作者首先使用CRISPR-Cas9进行了一系列实验，以确定T细胞激活途径的哪些近端信号蛋白对CAR参与后的效应功能是必要的。然后他们用细胞内信号分子PLCy1或截短的ZAP-70替换了CD3z和CD28或4-1BB共刺激信号域，并发现这些近端信号的CAR绕过了对TCR机制进一步上游成分的需求，同时启动了功能性T细胞反应。接下来，作者认为，近端信号通路的一些必要蛋白可能发挥协同作用，而每一种单独的蛋白可能无法诱发近端T细胞信号。由于LAT和SLP-76是ZAP-70的下游目标，形成了PLCy1的支架，并且在最初的CRISPR-Cas9基因敲除研究中都被证明是启动CAR T细胞活性的必要条件，作者通过将近端信号分子与一个跨膜结构域和一个针对不同抗原的scFv融合，产生了成对的LAT和SLP-76 CARs。表达LAT或SLP-76 CAR的T细胞无法诱导完全的T细胞激活，但两种CAR的共同表达和双抗原相遇引起了有效的T细胞反应。
为了避免对只表达一种抗原的靶细胞的反应出现泄漏，这些构建体通过在两个构建体之间交替使用CAR跨膜结构域和突变CD28跨膜结构域中的半胱氨酸残基以防止二聚化而得到进一步的改进。为了中断该系统中两个不同CAR的相互作用并消除任何剩余的泄漏，Tousley等人敲除了LAT和SLP-76结构域中适应蛋白GADS的结合位点，这对于建立一个真正的布尔逻辑和门平台至关重要。这种复杂的LINK CAR系统几乎只在两种抗原都被LINK CARs结合时激活T细胞。
在一个靶向、非肿瘤ROR1毒性模型中，针对ROR1和CD19的LINK CAR T细胞有效地消除了表达这两种目标抗原的肿瘤，而没有任何ROR1介导的毒性证据，这可能是由于ROR1在小鼠肺部组织上的表达导致的。此外，在一个B细胞移植实验中，作者证明LINK系统可以保护只表达一种目标抗原的正常组织。尽管使用共生小鼠模型可以更精确地分析靶向肿瘤毒性和表达一个目标的邻近良性组织的潜在旁观者杀伤力，但作者令人信服地表明，用LINK CAR T细胞治疗在这方面优于以前描述的其他AND门控CAR T细胞方法。LINK CARs显示了特异性和有效的抗肿瘤功效，而SynNotch和SPLIT CAR系统则与目标上、肿瘤外的毒性和对动物的致命后果有关。
因此，随着LINK CAR平台的开发，作者提供了一个优雅的策略，在保持高疗效的同时，大大减少了目标外肿瘤活动。该系统为靶向肿瘤细胞上共同表达的抗原提供了新的可能性，但在良性组织上却没有，现在依靠对恶性和正常细胞上组合表达模式的精确分析，成功地将LINK CARs扩展到新的治疗应用。
还需要进一步的工作来确定LINK CARs对抗原表达低的肿瘤细胞的表现。作者在CAR T细胞数量相对较多、肿瘤细胞上抗原密度相当高的情况下显示了有益的效果。鉴于CAR构建体中的信号域与它们的效应功能和抗原敏感性有关，LINK CARs的治疗效力必须对抗原密度不稳定的肿瘤进行评估，最好是在低CAR T细胞剂量的压力测试条件下。这些研究也将与实体瘤中的异质抗原表达水平有关，在这种情况下LINK CARs是一种特别有吸引力的治疗策略。此外，未来的研究应以评估肿瘤抗原逃逸为目标，因为与使用单特异性或OR门控CAR系统相比，LINK系统的激活需要两种抗原，这可能会导致抗原下调或丧失的更大倾向，而单特异性或OR门控CAR系统只需要表达一种抗原就能诱导T细胞完全激活。因此，仔细选择目标将是成功将LINK CAR T细胞系统转化为临床的关键。
此外，未来关于LINK CAR T细胞的工作应针对表征信号强度和相关特征，包括T细胞分化和衰竭。因为它绕过了CD3z和LCK，LINK系统与FDA批准的第二代CARs相比，在近端信号传导方面可能显示出相关的差异。这样的发现对于记忆的形成可能变得特别重要，这与基于4-1BB的CARs驱动TRAF2信号并与高持久性有关。
总的来说，这项研究令人印象深刻地展示了如何将细胞分子重新用于CARs，开辟了新的治疗方案，并扩大了可靶向分子的范围。LINK CAR T细胞在提高特异性和安全性方面具有很大的前景，这可能使CAR疗法成功地扩展到更多的患者群体。除了实体瘤，LINK系统的安全性增强也可能为治疗其他疾病提供新的希望，如自身免疫或衰老相关的疾病。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-023-05778-2
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