Nano Today | 基于普鲁士蓝纳米酶的基因编辑平台靶向 ROS 诱导的成骨细胞衰老和 RANKL 产生以逆转骨质疏松症

以下文章来源于纳米酶 Nanozymes ，作者Nanozymes

骨质疏松症中的微环境表现为炎症因子的浸润和活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的异常积累。研究表明ROS增加是诱导成骨细胞衰老的关键因素之一，将导致骨生成能力的急剧下降。同时，在骨质疏松微环境中成骨细胞分泌的核因子κB配体（Receptor activator of nuclear factor κB ligand, RANKL）增加，激活前体细胞向破骨细胞分化成熟，极大地增强了骨吸收活性，从而导致骨质疏松过程中成骨细胞-破骨细胞的恶性耦合机制。然而，目前仍缺乏有效的联合疗法来打破骨质疏松症中的恶性微环境。。

最近，扬州大学陈昊和王辉辉/中科院生物物理所高利增等人将普鲁士蓝纳米酶(Prussian blue nanozyme, PBzyme)原位生长在小尺寸中空二氧化硅纳米颗粒(Hollow mesoporous silica nanoparticles, H)表面，构建了一种复合纳米颗粒HPB，它呈现出强大的清除ROS能力。丰富的介孔结构使其可以将RANKL CRISPR/Cas9质粒和骨骼靶向剂阿仑膦酸钠(HPB@RC-ALN)结合在一起，调节骨质疏松微环境。在对小鼠进行治疗时，HPB@RC-ALN有效地清除了ROS，降低了氧化应激水平，扭转了骨质疏松微环境的异常代谢状态。同时，HPB@RC-ALN还敲除了衰老成骨细胞中的RANKL基因，切断了成骨细胞-破骨细胞的恶性耦合机制。构建的复合体可能为骨质疏松症的治疗提供一个新颖精确的平台。

图 1. HPB@RC-ALN通过有效清除ROS，阻断RANKL的产生，从而抑制成骨细胞的衰老和破骨细胞的活化，最终打破骨质疏松微环境中成骨细胞-破骨细胞的恶性偶联机制。

该团队采用反相微乳液制备H，然后通过水热法将PBzyme生长在小尺寸H表面得到HPB，H和HPB表现为均匀分散的球形形态，平均尺寸分别为46.68 ± 2.39和48.03 ± 2.85 nm。各类表征表明PB与H成功结合，其中Fe元素存在于纳米复合体的轮廓上，说明PB生长在纳米颗粒的表面（图 2）。此外，合成的HPB具有多种酶活性，包括SOD酶活，CAT酶活以及GPx酶活，显示出优越的ROS清除能力（图 3）。

接下来，该团队通过琼脂糖凝胶电泳确定材料搭载RC质粒的最佳质量比。将HPB@RC-ALN与MC3T3-E1细胞孵育后发现RC质粒随时间的延长在细胞中显著表达。流式细胞术也进一步证明HPB@RC-ALN具有优异的细胞转染能力。T7核酸内切酶I检测进一步证实了RC的基因编辑能力。采用qPCR和WB分析观察到HPB@RC-ALN组RANKL表达进一步降低，说明HPB@RC-ALN组携带的RC质粒具有有效的RANKL基因编辑功能（图 4）。

接下来，该团队在卵巢切除术(ovariectomy, OVX)处理小鼠的股骨切片上通过活性氧探针、衰老相关的β-半乳糖苷酶(Senescence-associated β-galactosidase, SA-β-Gal)和骨钙素（OCN）/P21染色等方法检测HPB@RC-ALN对骨质疏松微环境的影响。在实验中，观察到骨髓腔内的ROS积累和衰老成骨细胞数量明显增加。值得注意的是，成骨细胞的衰老伴随着OCN的表达减少，这表明衰老的成骨细胞的骨形成能力下降。然后采用TRAP染色对股骨切片进行研究，观察到OVX小鼠骨架中的破骨细胞数量明显增加。这可能是由于在骨质疏松的情况下，ROS的积累诱发了微环境的变化。为了证明成骨细胞衰老是由ROS引起，将线粒体靶向氧化还原循环剂MitoPQ与MC3T3-E1细胞共孵育后，进行SA-β-Gal染色，显示骨细胞呈现明显的衰老，处于G0&G1期的MC3T3-E1细胞和P21阳性成骨细胞明显增加。这些数据表明，ROS的异常积累导致了成骨细胞的衰老和破骨细胞的过度激活，最终促进了骨质疏松的进程（图 5）。

最后，在OVX小鼠模型中确定纳米酶-基因编辑平台的抗骨质疏松作用。如图 6所示，采用micro-CT扫描及三维重建发现，接受HPB@RC-ALN治疗的小鼠表现出最大的骨体积分数、骨小梁数目、骨小梁厚度增高和骨小梁间距降低。在各组中HPB@RC-ALN的骨质疏松挽救能力最好。H&E和OCN染色结果与micro-CT趋势一致，OVX小鼠中OCN表达显著降低，HPB@RC-ALN中趋势相反。

总而言之，该研究提出了一种新型的通过有效抑制ROS以及RANKL的过量分泌的联合治疗方式调控骨质疏松恶性微环境，为骨质疏松的高效治疗提供了新的策略。

转自：“NANO学术”微信公众号

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