ACS Chem. Biol. | 用于活细胞高尔基体成像的棕榈酰化依赖性小分子荧光探针

英文原题：Palmitoylation-Dependent Small-Molecule Fluorescent Probes for Live-Cell Golgi Imaging

供稿人：郭福虎 北京大学/西北师范大学

大家好，今天为大家介绍一篇 ACS Chemical Biology 文章，标题为“Palmitoylation-Dependent Small-Molecule Fluorescent Probes for Live-Cell Golgi Imaging”，文章的通讯作者是来自日本名古屋工业大学的 Shinya Tsukiji教授。

高尔基体的异常形态，伴随着各种神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症 (ALS) 和帕金森病，以及癌症。因此，可视化活细胞中高尔基结构对于研究高尔基相关细胞生物学和疾病是必不可少的。

虽然基于荧光蛋白的高尔基体标记物已经被开发出来并用于活细胞高尔基体可视化，但基因编码的探针需要外源质粒转染，这耗时并且仅适用于适合转染的细胞。此外，基于荧光蛋白的高尔基体标记物的外源性（过度）表达通常会破坏正常的高尔基体形态。虽然目前已经开发几种基于神经酰胺脂质的高尔基体小分子荧光探针，但该神经酰胺探针存在一个严重的局限性，只有在 20°C下才能高效的在高尔基体中富集，在 37°C 时就会扩散到内质网。尽管神经酰胺探针存在这局限性，但由于缺乏其他设计策略，基于高尔基体的小分子荧光探针的开发并没有取得任何进展。

在此，作者报告了一类新的高尔基体定位小分子荧光探针。该设计是基于他们之前发现的棕榈酰化基序，该基序由三-N-甲基化肉豆蔻酰基-Gly-Cys (myrGC3Me ) 脂肽组成，当Cys 残基在高尔基体表面被棕榈酰酰基转移酶 (PAT) 棕榈酰化后，可以特异性的定位于高尔基体膜。因此，作者推测将 myrGC3Me基序模块化连上感兴趣的荧光染料，所得结合分子就可以充当高尔基体定位荧光探针，实现活细胞中高尔基体的可视化（图 1a ）。

作者采用的第一种荧光染料是荧光素 (FL)，通过灵活的接头将 myrGC3Me基序连接到荧光素二乙酸酯 (FDA) 上，从而合成了 mgc3MeFDA ( 1 )（图 1b）。进入细胞后，mgc3MeFDA很容易通过细胞内酯酶水解 FDA 的乙酰基转化为 mgc3Me FL（荧光素形式）。接下来，作者使用人类上皮 HeLa 细胞评估了 mgc3MeFDA的高尔基体定位能力。FL荧光主要在mgc3MeFDA处理的细胞的核周高尔基体区域中观察到（图2a），表明 mgc3MeFDA可以高特异性可视化高尔基体。

为了评估mgc3MeFDA 作为活细胞高尔基荧光染色剂的实用性，作者将其与市售的 BODIPY FL 和 BODIPY TR 神经酰胺探针进行了对比，发现BODIPY FL 和 BODIPY TR 神经酰胺探针虽然能定位于高尔基体，但两种探针也定位于其他细胞内膜，主要是内质网，导致显着水平的非特异性背景信号（图 2 e、f）。此外，作者也将mgc3MeFDA应用于非洲绿猴肾COS-7、小鼠成纤维细胞NIH3T3、人胚肾HEK293、人T淋巴细胞Jurkat细胞等多种细胞系，发现都具有优异的高尔基体染色特异性。为了研究高尔基体探针设计的普遍性，作者接下来将 myrGC3Me基序应用于不同的荧光染料，即 7-(二乙氨基) 香豆素 (DEAC)、四甲基罗丹明 (TMR) 和 Janelia Fluor 549 (JF549)。发现这几种染料探针均比 BODIPY FL 和 BODIPY TR 神经酰胺探针有更高的高尔基体染色特异性（图 2 b–g）。

最后，作者研究了基于 myrGC3Me的荧光探针是否可用于可视化活细胞中高尔基体形态的动态变化。当用 mgc3MeFDA 染色的 HeLa 细胞与 BFA (1 μM) 一起孵育时，高尔基体衍生的荧光在 10 分钟内消失（图 3a）。相反，当使用 DMSO 进行相同的实验时，并没有观察到高尔基体荧光的消失（图 3a）。为了克服这个问题，作者在含有 mgc3MeFDA (2.5 μM) 的培养基中培养细胞，并在没有任何清洗程序的情况下进行延时成像。在这种情况下，虽然由于 mgc3Me FL 与 PM 的外叶结合而观察到质膜 (PM) 荧光，但高尔基体被清楚地染色（图 3b). 此外，作者还应用该探针观察了有丝分裂过程中的高尔基体动态变化，包括亲本细胞中高尔基体的消失和随后在两个子细胞中的高尔基体重组（图3b）。

最后对这项工作进行一个总结：作者将基于 myrGC3Me的合成棕榈酰基化基序与各种有机荧光团缀合，以展示一种用于创建小分子活细胞高尔基体染色荧光探针的新型通用策略。通过将这种模块化设计方法应用于香豆素、荧光素、罗丹明和 Janelia Fluor 染料，生成了蓝色、绿色和红色荧光高尔基体染色剂，所有这些都显示出比现有的基于神经酰胺的探针更高的高尔基体定位特异性（即使在 37 °C 下）。 基于myrGC3Me的高尔基体探针没有细胞毒性，可以通过简单的孵育和洗涤程序快速染色各种细胞系的高尔基体。使用 mgc3MeFDA 作为代表性探针，作者还通过可视化药物处理和细胞分裂过程中诱导的高尔基体形态的动态变化，展示了探针的多功能性。因此，预计这项工作中报道的 myrGC3Me系荧光团适合作为实用易用的探针，用于可视化活细胞中正常和异常的高尔基体形态，这将促进（高尔基体相关的）细胞生物学研究和疾病诊断。此外，myrGC3Me束缚策略应适用于多种荧光染料，包括具有独特光化学或传感特性的荧光染料，以进一步扩展用于化学生物学研究的高尔基体靶向荧光探针工具箱。

转自：“ACS美国化学会”微信公众号

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