《自然—方法》：王友军/章晓辉/唐爱辉合作开发出目前反应亮度最高的钙离子荧光蛋白探针

2023年4月20日，北京师范大学王友军团队、章晓辉团队与中国科技大学唐爱辉团队等在国际知名学术期刊《自然—方法》（Nature Methods）上发表研究论文，开发了采用全新策略构建的新型高灵敏钙离子探针。

生命体的许多活动都离不开钙离子（Ca2+）信号分子。细胞内钙离子浓度时空变化被称之为钙信号，它控制或调节各种细胞生命活动。开发灵敏和精准的钙信号检测探针工具，对探究生命活动相关的信号机制和规律至关重要。目前在领域内被广泛应用的遗传编码的钙信号（荧光）探针（genetically encoded Ca2+ indicators, GECIs）工具为GCaMP系列。GECI主要由钙感知（如结合钙的钙调蛋白CaM及其靶肽M13/RS20）和荧光反应两大模块组成。通过改变CaM、M13与荧光蛋白三个元件之间的连接方式、连接短肽及互作界面中的关键氨基酸等方式，会改变GECI的表现。目前应用最广泛的GCaMP（2-8）系列，其钙感知部分包括钙结合蛋白（如钙调蛋白CaM）及其靶肽（如M13/RS20），产生荧光变化的部分为环化重排的绿色荧光蛋白cpGFP（图1A）。经过二十多年来的各种改造，研究者们逐步优化了GECI的灵敏度和反应速度，但它们的反应幅度，即对钙信号大小的分辨率始终有待提高。

在这篇最新论文中，为了增强GECI对钙离子浓度变化的荧光响应，合作团队采用更亮的新型荧光蛋白mNeonGreen（mNG）来替换广泛使用的cpGFP，构建了基于不同设计策略的几十种复合GECI分子。通过系统的钙离子成像筛选，优选出一组名为NEMO的新型GECI探针（图1B），体外鉴定发现，NEMO相比现有的GCaMP系列探针具有更高的反应荧光强度、更好的抗光淬灭能力与pH稳定性，并能实现对钙离子绝对浓度的定量检测。

图1：单荧光遗传编码钙探针（GECI）的常见构建方式。A) GCaMP方式；B）NEMO的构建方式

本研究在非兴奋性细胞系（图2A）、原代培养的神经元（图2B）和小鼠脑内（图2C）等多种体系中对NEMO的性能进行了系统测试。NEMO探针首次实现了对细胞内钙活动的超过100倍的荧光反应幅度。相比于最新的jGCaMP8f和最广泛使用的GCaMP6s，NEMO系列探针对胞内钙信号的反应速度相当，但更灵敏，具有更高的信噪比，且荧光反应幅度提高约10倍。其中的NEMOf具有更快的相应动力学，适合检测快速信号；NEMOs具有更高的钙结合常数，适用于微小钙信号的成像；NEMOc具有更大的钙离子结合动态范围，适宜用更大的钙信号检测；而NEMOm在各方面的性能相对比较平衡，是一个更通用的多面手版本。总之，NEMO工具因其对钙离子的超高反应幅度，对胞内钙信号或钙依赖的细胞活动大小具有更高的分辨率，将为神经元活动及细胞钙信号的时空变化提供了一组更优的工具。

图2：NEMO钙探针在（A）非兴奋性细胞，（B）分离神经元及（C）小鼠在体脑神经元中的反应示例

本项工作受到国家基金委重大研究计划及面上项目、国家科技创新2030计划、科技部重点研发计划以及博士后基金等的支持。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1038/s41592-023-01852-9

转自：“小柯生命”微信公众号

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