低温冻害尤其是倒春寒是造成小麦减产的重要因素之一。挖掘小麦低温抗性关键基因，解析低温响应机制，为培育出小麦低温抗性品种提供理论基础。巴豆酰化修饰 (crotonylation, Kcr) 是发生在赖氨酸（lysin，K）上的酰化修饰，在医学领域有较快研究进展，主要涉及调控DNA损伤和修复、转录沉默和修复、炎症、抑郁症等。Kcr参与植物的转录调控和逆境响应，2018年水稻中报道了首个植物中的Kcr eraser (OsSRT2)。目前，Kcr在植物领域的功能研究仍较少。
2023年5月10日，河南农业大学陈锋团队在Science Advances在线发表了题为Global crotonylatome and GWAS revealed a TaSRT1-TaPGK model regulating wheat cold tolerance through mediating pyruvate的研究论文，揭示了TaSRT1-TaPGK model调控小麦低温抗性的新机制。
为了阐明Kcr是否普遍存在于小麦中，研究者首先利用Kcr抗体进行western blot分析，发现Kcr在六倍体小麦 (AABBDD) 及其近缘种二倍体和四倍体中分布广泛，并响应多种非生物胁迫，尤其是温度。高温条件下Kcr水平显著降低，低温条件下Kcr水平主要在25 ~ 130 kDa范围内升高，表明Kcr水平可能参与低温调控。为了明确小麦的Kcr特征，构建了首个普通小麦巴豆酰化修饰图谱。巴豆修饰组学共鉴定到4,696 Kcr位点，涉及1726个蛋白；Kcr蛋白的修饰位点数有丰富的变异；在蛋白质Traids鉴定出75个Kcr蛋白(2%)（图1）。Kcr蛋白广泛分布在叶绿体、细胞质、细胞核、线粒体等涉及到photosynthesis、oxidative phosphorylation、carbon metabolism等多种生物学途径。
为了挖掘小麦中关键的低温响应基因，将Kcr组、F10 代RIL群体的低温抗感混池的BSR-seq、BSP-TMT结合多年多点冻害GWAS进行联合分析，共鉴定到12个候选基因。将12个候选基因在406份小麦材料中进行测序，共鉴定到126个多态性标记，将这些标记加入到小麦660K和90K SNP 芯片中进行冻害表型的GWAS。3个候选基因的10个多态性标记在多个环境均被显著检测到。其中，候选基因TaPGK (phosphoglycerate kinase, 磷酸甘油酸激酶) 在小麦根和叶中均为高表达。GWAS结果显示，TaPGK（PGKc）的多态性标记在660K和90K两个群体中均显著。测序结果显示，TaPGK在RIL-SC的两个亲本间存在7个SNP。单倍型分析结果显示，Hap2 (SC-1) 在小麦中表现出更强的低温抗性（图2）。RT-PCR结果显示TaPGK受低温诱导。这些研究表明，TaPGK与小麦的耐寒性密切相关。
对TaPGK进行低温响应功能验证。BC2代的EMS突变体、T2代TaPGK-OE和CRISPR/Cas9的突变体的低温表型实验和生理指标REC、H2O2 和 MDA测定结果证实TaPGK正向调控小麦低温抗性（图3）。
为了解析TaPGK Kcr与低温关系，在小麦、烟草以及小麦原生质体水平进行了Kcr生化实验。对低温处理后小麦和TaPGK-OE分别用特异性TaPGK抗体进行IP实验，结果表明TaPGK的Kcr受低温诱导。LC-MS/MS和多组学分析结果显示K35、K206和K366是TaPGK的关键位点，且只被Kcr修饰。对3个关键Kcr位点进行点突变模拟去巴豆酰化修饰，在烟草中进行瞬时过表达。结果显示，与WT相比，TaPGKK206R的Kcr、PGK酶活性以及蛋白丰度均显著下降。进一步将TaPGKK206R和WT在小麦原生质体中进行瞬时过表达。发现低温胁迫显著提高了TaPGK的Kcr水平，但对TaPGKK206R的Kcr水平没有明显影响，表明K206是TaPGK响应低温的关键Kcr位点（图4）。
为了探究TaPGK调控小麦低温抗性的机制，以TaPGK为诱饵，通过酵母双杂交 (Y2-H) 筛选小麦cDNA文库。鉴定出一个去乙酰化酶TaSRT1。进一步通过Y2-H、LUC和Pull down证实TaSRT1和TaPGK存在互作（图5）。由于TaSRT1与TaPGK存在互作，研究者推测TaSRT1的表达可能影响小麦的低温抗性。进一步对TaSRT1进行低温响应功能验证。BC2代的EMS突变体、T2代TaSRT1-OE低温表型实验和生理指标REC、H2O2 和 MDA测定结果证实TaSRT1负向调控小麦低温抗性。
为了阐明TaSRT1调控TaPGK的机制，在烟草中和小麦原生质体分别进行瞬时共表达实验。结果表明，TaSRT1在烟草和小麦原生质体水平抑制TaPGK蛋白积累。进一步利用TaSRT1 EMS突变体、TaSRT1-OE、烟草、小麦原生质体、原核表达体系等一系列实验证实了TaSRT1是TaPGK的去巴豆修饰酶（图5）。TaSRT1存在时，TaPGK酶活性显著下降。推测：TaSRT1可能通过去巴豆酰化修饰抑制TaPGK蛋白积累。
在植物中，PGK是糖酵解过程中高度保守的可逆关键酶。糖酵解在植物的低温响应中起重要作用。为什么TaPGK会影响小麦的耐寒性？为了找到答案，研究者对低温胁迫前后TaSRT1-OE植株和WT的进行了转录组测序。发现7个糖酵解基因受到TaPGK和低温诱导；并通过qRT-PCR对TaPGK邻近的4个基因进行了证实。丙酮酸作为糖酵解的底物是否会影响小麦的低温抗性？研究者进一步对TaPGK和 TaSRT1突变体和过表达材料进行丙酮酸含量测定。结果显示，丙酮酸含量均显著变化。外源丙酮酸实验结果表明，丙酮酸显著增强Fielder、TaPGK EMS 突变体和Cas9突变体的低温抗性（图6）。这些研究结果表明，TaPGK-TaSRT1 model可能通过调节小麦植株的丙酮酸含量来调控小麦低温抗性。
综上所述，研究者提出TaSRT1-TaPGK model调控小麦低温抗性的新机制：低温下调TaSRT1的表达，使TaSRT1对TaPGK的去巴豆修饰功能减弱，增加TaPGK的表达，从而促进丙酮酸的积累，减少小麦植株的低温损伤 (图7)。此外，本研究还提出丙酮酸可以作为一种潜在的重要物质来缓解小麦的冻害。
最后，研究者对全球1168份小麦品种进行单倍型分析。结果表明，抗性单倍型TaPGK-hap2在全球范围内广泛分布，但所占比例相对较低 (图8)，表明TaPGK在提高小麦低温抗性方面具有巨大潜力。
河南农业大学农学院青年教师张宁副教授、硕士研究生王思圣为论文的共同第一作者，陈锋教授为本文的通讯作者。硕士研究生赵思敏、陈代英、田红燕、李佳、李松刚、刘露，博士研究生张灵然、博士后石超男，青年教师余晓东和任妍副教授参与了部分研究工作。
转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号
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