马铃薯（Solanum tuberosum L.）是重要的粮菜兼用作物，也是重要的工业生产原料。由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum，以下都简称青枯菌）引起的青枯病（Bacterial wilt）是马铃薯生产中危害最大的细菌性病害，然而由于马铃薯抗病种质资源的缺乏和病原菌-青枯雷尔氏菌的复杂性，针对马铃薯青枯病病害尚未有很好的治理方法。虽然培育具有青枯病抗性的品种是最高效且最直接的防治方式，但马铃薯栽培品种缺乏青枯病抗源，近年来抗病育种收效甚微。在长期的自然进化过程中，青枯菌的效应蛋白已充分进化适应了马铃薯的免疫系统，可以作为研究马铃薯免疫不可多得的分子探针。因此，利用效应蛋白来挖掘植物免疫系统的关键蛋白已成为植物免疫研究的一种新思路，为马铃薯抗病育种提供理论基础。
近日，华中农业大学马铃薯团队在Frontiers in Plant Science、Molecular Plant Pathology、Journal of Experimental Botany和Horticulture Research上分别发表了题为 “Comparative genomic analysis of Ralstonia solanacearum reveals candidate avirulence effectors in HA4-1 triggering wild potato immunity”、“A novel effector RipBT contributes to Ralstonia solanacearum virulence on potato”、“Protein phosphatase StTOPP6 negatively regulates potato bacterial wilt resistance by modulating MAPK signaling”和“Ralstonia solanacearum type III effector RipAS associates with potato type one protein phosphatase StTOPP6 to promote bacterial wilt”、的研究论文，报道了该研究团队在马铃薯与青枯菌互作机制方面的研究进展。
团队在前期研究中对侵染马铃薯的青枯菌测序基础上，进一步筛选调控马铃薯青枯病抗性的核心效应蛋白（Mengshu Huang et al., 2023. Frontiers in Plant Science, doi: 10.3389/fpls.2023.1075042）。研究发现对接种马铃薯材料出现抗感分离现象的两个青枯菌进行基因组测序比较得到8个差异效应蛋白。对预测无毒蛋白进行进一步序列分析与致病力鉴定，结果发现在毒力菌株HZUA091中表达RipA5HA4-1和RipBSHA4-1，会增强马铃薯野生种ALB28-1的抗性；在HA4-1中分别突变RipS6，RipO1，Hyp6和RipBS，会降低马铃薯野生种ALB28-1的抗性（图1）。其中RipBS是团队新鉴定到的一个具有LRR-Fic蛋白结构域的青枯菌Ⅲ型分泌系统效应蛋白，有望成为深入挖掘马铃薯与青枯菌互作机制的突破点。
图1. HA4-1中效应蛋白突变体的致病力鉴定
该团队使用cyaA报告系统进行功能鉴定，发现了一种新的Ⅲ型效应蛋白RipBT（Huishan Qiu et al., 2023. Molecular Plant Pathology, doi: 10.1111/mpp.13342）。RipBT在本氏烟草中瞬时表达，以依赖于质膜定位的方式诱导强烈的细胞死亡。将青枯菌的RipBT突变掉，其对马铃薯的致病力显著减弱；而将RipBT在马铃薯植株中稳定表达，会显著降低马铃薯对青枯病的抗性。进一步通过转录组学分析发现，RipBT可能在青枯菌侵染马铃薯过程中，干扰植物活性氧（ROS）代谢。此外，RipBT的表达显著抑制flg22诱导的PTI反应，包括ROS爆发和PTI标记基因的表达。综上所述，RipBT是一个新鉴定的Ⅲ型效应蛋白，促进青枯菌侵染马铃薯，并可能扰乱ROS稳态。这一发现拓展了马铃薯和青枯菌互作方面的的研究，为挖掘植物对抗青枯病的策略提供理论依据。
图2. RipBT的功能鉴定
关于马铃薯免疫相关基因的挖掘工作，该团队鉴定了属于Ⅰ型蛋白磷酸酶（TOPPs）家族的成员StTOPP6，并且沉默 StTOPP6 增强了对马铃薯青枯菌的抗性（Bingsen Wang et al., 2023，Journal of Experimental Botany, doi：10.1093/jxb/erad145）。RNA-seq分析表明，StTOPP6 的沉默激活了MAPK3介导的下游信号通路。而StMAPK3的过表达增强了对青枯菌的抗性，这表明了StTOPP6在马铃薯青枯病抗性的负调控作用。研究进一步发现过表达磷酸酶酶活突变体StTOPP6m也能激活MAPK3介导的下游信号通路同时增强马铃薯对青枯病抗性，并且能对StTOPP6与MAPK3的互作形成竞争性抑制，表明 StTOPP6对免疫的调控需要其磷酸酶活性。该研究结果揭示马铃薯蛋白磷酸酶StTOPP6在马铃薯免疫调控中的功能，并明确其下游调控途径，阐述调控青枯病抗性的机制（图3），丰富马铃薯免疫调控的理论基础。
图3. StTOPP6调控马铃薯免疫的模式猜想
蛋白磷酸酶是植物免疫的关键调节因子，并且已经有报道表明病原菌可以靶标蛋白磷酸酶来调控宿主免疫。为了验证青枯菌是否也存在效应蛋白与蛋白磷酸酶存在关联，该团队通过构建青枯菌效应蛋白的酵母文库筛选得到了与蛋白磷酸酶StTOPP6互作的III型效应蛋白RipAS（Bingsen Wang et al., 2023，Horticulture Research, doi：10.1093/hr/uhad087）。对RipAS的毒力功能进行验证发现，RipAS是一个能帮助R. solanacearum侵染的毒力效应蛋白，并且 RipAS 在马铃薯中的稳定表达能够削弱马铃薯对R. solanacearum的抗性。蛋白共表达后发现，RipAS 能够抑制StTOPP6 的核仁中的表达，并且在R. solanacearum侵染期间StTOPP6受到同样的影响（图4）。进一步研究发现，RipAS对StTOPP6核仁表达的抑制也广泛存在于其他Ⅰ型蛋白磷酸酶和RipAS 之间。因此，我们认为RipAS是一种与Ⅰ型蛋白磷酸酶相关的毒力效应蛋白，但是其中的具体机制有待进一步挖掘。
图4. RipAS的表达抑制StTOPP6在核仁中的蛋白积累。
发表于Frontiers in Plant Science杂志的研究，博士研究生黄萌姝和已毕业的谭晓丹博士（现任职于仲恺农业工程学院）共同担任第一作者，陈惠兰教授和王炳森博士为共同通讯作者；发表于Molecular Plant Pathology 杂志的研究，博士研究生邱惠珊为第一作者，陈惠兰教授担任通讯作者；发表于Journal of Experimental Botany和Horticulture Research杂志的研究，王炳森博士为第一作者，陈惠兰教授和宋波涛教授担任该论文共同通讯作者。
该系列研究均由果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室/农业农村部马铃薯生物学与生物技术重点实验室发表，并得到国家自然科学基金（32201789、31871686）、现代农业产业技术研究体系（CARS-09）专项资金以及广东省基础与应用基础研究基金项目（2022A1515110018）的支持。
华中农业大学马铃薯团队是农业农村部马铃薯生物学与生物技术重点实验室和湖北省马铃薯工程技术研究中心等省部级研究平台的依托单位，也是果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室和国家蔬菜改良中心华中分中心的重要组成部分。团队现有在职教师7人，其中教授3人、副教授3人、高级农艺师1人，博士后6人，现有70余名博士和硕士研究生参与课题研究。围绕产业发展的重大科学与技术问题，开展应用基础与共性技术研究，经过20多年的努力，形成了马铃薯种质资源创新、重要性状功能基因组、遗传育种、种薯繁育和农机农艺融合等优势研究领域。团队收集保存了马铃薯野生种、近缘种、栽培种和种间杂种等各类资源2000余份；系统完成了马铃薯资源晚疫病、青枯病、病毒病等抗性鉴定及抗寒性和品质性状评价；建立了原生质体融合技术平台，获得首批抗青枯病、抗寒种间体细胞杂种，创造出了一批具有抗性突出、遗传背景广泛的亲本材料；开展了块茎发育、低温糖化和抗寒等重要性状形成分子与遗传机制解析，揭示了晚疫病、青枯病和病毒病等植株抗性形成的遗传基础和植物-病原互作的分子机制，建立了相应的分子标记辅助选择体系，为抗性改良和育种技术创新提供了理论支撑和技术平台；提出了块茎发育的分子生理机制，发明了试管薯高效生产技术，创新了种薯繁育体系；建立了马铃薯南方马铃薯“深沟宽垄全覆膜”机械化栽培技术。育成新品种22个，获植物新品种权5项，获国家发明专利20余项，获湖北省科技进步一等奖、湖北省技术发明一等奖、农业部全国农牧渔业丰收一等奖等科技奖项，发表学术论文300余篇。
文章链接：
Huang, M., Tan, X., Song, B., Wang, Y., Cheng, D., Wang, B., & Chen, H. (2023). Comparative genomic analysis of Ralstonia solanacearum reveals candidate avirulence effectors in HA4-1 triggering wild potato immunity. Frontiers in Plant Science, 14. https://doi.org/10.3389/fpls.2023.1075042.
Qiu, H., Wang, B., Huang, M., Sun, X., Yu, L., ... & Chen, H. (2023) A novel effector RipBT contributes to Ralstonia solanacearum virulence on potato. Molecular Plant Pathology, 00, 1– 14. https://doi.org/10.1111/mpp.13342.
Wang, B., Huang, M., He, W., Wang, Y., Yu, L., Zhou, D., ... Song, B., & Chen, H. (2023). Protein phosphatase StTOPP6 negatively regulates potato bacterial wilt resistance by modulating MAPK signaling. Journal of Experimental Botany, erad145-erad145. https://doi.org/10.1093/jxb/erad145.
Wang, B., He, W., Huang, M., Feng, J., Li, Y., Yu, L., ... Song, B., & Chen, H. (2023). Ralstonia solanacearum type III effector RipAS associates with potato type one protein phosphatase StTOPP6 to promote bacterial wilt. Horticulture Research, uhad087. https://doi.org/10.1093/hr/uhad087.
图文来源：植物科学最前沿公众号
转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号
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