以下文章来源于Ad植物微生物 ，作者潘潘
摘要
大多数植物都能与丛枝菌根真菌(AMFs)形成共生关系，促进寄主植物对土壤养分的吸收。与磷营养相比，菌根吸收氮(N)的分子机制仍然很不清楚，其生理相关性也不清楚。
在这里，我们在玉米(Zea Mays)根中发现了一个编码AMF诱导的氨离子转运蛋白ZmAMT3;1的基因。ZmAMT3;1在含丛枝的皮层细胞中特异表达，编码蛋白定位于质膜。在酵母和非洲爪蛙卵母细胞中的功能分析表明，ZmAMT3;1介导了高亲和力的铵离子转运，底物为NH4+，但可能转运未带电的NH3。ZmAMT3;1在C末端的磷酸化抑制了转运活性。在室内盆栽试验中，利用ZmAMT3;1-RNAi转基因玉米品系，我们证明大量的N从AMF转移到植株，其中68%-74%是由ZmAMT3;1介导的。在田间条件下，依赖于ZmAMT3;1的菌根N途径贡献了大于30%的氮素吸收。此外，AMFS还下调了ZmAMT1;1a和ZmAMT1;3在根表皮中表达的蛋白丰度和运输活性，这表明菌根和根直接吸收N的途径之间存在权衡。
为了确定参与Myc途径的质膜定位的铵转运体(AMT)，我们的目标是确定这条途径对植物整体N营养的重要性。综上所述，我们的研究结果提供了对玉米依赖菌根的氮素吸收的全面了解，并为通过植物-微生物相互作用提高氮素获取效率提供了一条有前途的途径。
引言
AMF共生的形成被认为是植物为应对营养缺乏而进化的一种策略，因为AMF的根外菌丝从根部和根毛无法获得的土壤中获取养分，许多研究表明AMF还将N转移到寄主植物(Myc-N途径)。生理生化证据表明，AMF的根外菌丝(ERM)从土壤中吸收无机(硝酸盐和铵)和有机(氨基酸和小肽)N源，并将其迅速代谢为精氨酸，然后，将ERM中的Arg与聚磷酸盐一起转移到根内菌丝(IRM），并分解成铵(NH4/NH3)，随后释放到根和菌根真菌之间的质外体中。
许多植物AMT基因是由AMF特异诱导的，它们的编码蛋白定位在质膜上，这些转运蛋白被认为在共生界面上调节NH3或NH4的运输。然而，MtAMT2; 3不运输铵，而是充当调节丛枝发育的铵传感器，从而影响共生养分(N和P)的获取。因此，AMT介导的跨质膜的氨离子转运Myc-N的性质在很大程度上仍不清楚。AMF可以将N转移到寄主植物，但Myc-N吸收对植物整体N营养的贡献，特别是在田间条件下，仍然存在争议。
在本研究中，我们利用转录组的方法，在玉米(Zea Mays)中克隆了一个菌根诱导的氨离子转运蛋白(AMT)基因ZmAMT3;1，并发现该编码蛋白仅定位于质膜。在酵母和非洲爪蛙卵母细胞中的异源表达表明，ZmAMT3;1蛋白介导的高亲和力铵以NH3为底物转运。我们获得了ZmAMT3;1-RNAi转基因玉米植株，并通过盆栽试验量化了ZmAMT3;1依赖的Myc-N吸收的表型效应。在两年的田间试验中，进一步确定了ZmAMT3;1对氮素吸收的显著贡献。我们的研究证实了ZmAMT3;1在Myc-N途径中的重要作用，并强调了AMF与植物整体氮素营养的生理相关性，为提高作物的氮素利用效率提供了一条新的途径。
结论
1、AMT ZmAMT3; 1在玉米中的菌根诱导表达
图1A: 对接种或不接种AMF的玉米根的转录分析表明，在8个玉米AMT基因中，有1个基因ZmAMT3;1被AMF显著诱导
图1B: 利用RT-qPCR，发现ZmAMT3;1在田间生长的玉米植株的根中表达，但在无法与AMF建立共生关系的水培植株的根中不表达
图1C: 在盆栽试验中，使用不同的AMF菌株，使该基因在玉米根中的转录显著增加
图1E和F: 在接种AMFs后14-42天的时间实验中，ZmAMT3;1的表达水平在28dpi时显著增加，与增强的根长定植相关
图1G: ZmAMT3;1在菌根中的表达持续增加，并在成熟期达到最大水平
图1D，F和H: 菌根化玉米磷转运蛋白基因ZmPht1; 6是菌根共生标记基因，其表达水平与ZmAMT3;1在不同AMF处理下的表达变化一致
图1:菌根诱导AMT ZmAMT3; 1在玉米根中的表达
2、ZmAMT3;1仅在含丛枝的细胞中表达，编码蛋白定位于质膜
图2A: 我们用原位杂交的方法研究了ZmAMT3;1在42dpi玉米菌根中的细胞定位。使用与反义探针的高严格杂交，在含有丛枝的皮质细胞中检测到强烈的信号
图2B: 然而，在这些定植的细胞中，通过与正义探针杂交没有检测到信号
图2C-E: 进一步利用表达ZmAMT3;1启动子：GUS(β-葡萄糖苷酶)融合构建体的转基因玉米根来检测ZmAMT3;1基因在菌根中的细胞特异性表达
图2D和E: 通过菌根横切面和纵切面的GUS组织化学染色，在菌根的皮层中检测到较强的GUS活性。根切片与AM真菌结构的特异性染料WGA488共染色进一步证实，ZmAMT3;1启动子依赖的GUS活性在含有高度分枝丛枝的AMF定植的皮层细胞中表达，而在只含细胞内菌丝的细胞或未定植AMF的细胞中不表达。
图2: ZmAMT3; 1在玉米根中的丛枝皮层细胞特异性表达及质膜定位
3、ZmAMT3;1介导酵母高亲和力铵转运和卵母细胞NH3转运
ZmAMT3;1的功能通过在酵母三重Dmep(1-3)突变体(31,019b)中的异源表达来验证，该突变体在高亲和力铵吸收方面存在缺陷
图3A: ZmAMT3;1的表达恢复了以0.5-10 mM NH4为唯一氮源(pH 5.5)的酵母突变株的生长, ZmAMT3;1的生长补充作用与AtAMT2；1一样，不随pH变化
图3B: 在酵母中进一步进行了15N标记的铵内流试验，以评估当外部15NH4浓度从10到500μm时ZmAMT3;1的动力学性质
这些结果表明ZmAMT3;1编码了一个功能性的高亲和力AMT
在酵母中，ZmAMT3;1的活性与外部pH无关，这表明转运蛋白吸收的是NH4，而不是NH3，因为在一定的氨浓度下，NH4的浓度在pH 3.5~ 7之间相当稳定，而NH3的浓度每pH单位下降10倍。
图3C-F: 为了确定ZmAMT3;1的转运蛋白特性，我们在卵母细胞中进行了异源表达。当进行电生理测试时，表达ZmAMT3;1的卵母细胞在NH4供应下没有表现出内向电流的变化。因此，铵的传输与离子流无关，这表明ZmAMT3;1可能传输的是不带电荷的NH3，而不是离子NH4。
图3：ZmAMT3；1在酵母和卵母细胞中的铵转运
4、ZmAMT3;1的转运活性受C末端磷酸化的调节
图4A: 蛋白质序列的系统发育分析表明，禾本科植物中的AMT3簇成员包括三个亚簇：Amt3;1，Amt3;2和Amt3;3。CTR序列比对显示了三个保守的假定磷酸化位点，相当于ZmAMT3;1个T465、S471和T485
图4B: 为了探索可能的磷酸化位点是否参与调控ZmAMT3;1转运蛋白活性，在酵母突变体31019b中功能性地表达了磷酸化或去磷酸化的突变体。突变体的稀释液在有2mM铵作为唯一氮源的YNB板上生长4天。
图4C: 与Wt或去磷酸化突变体的卵母细胞相比，表达ZmAMT3;1磷模拟突变体T475D或S482D的卵母细胞，15N标记的铵积累减少
这些结果表明，ZmAMT3;1转运体的活性可以通过保守位点的磷酸化来下调。
图4: 酵母和卵母细胞中ZmAMT3; 1的磷酸化突变体的功能特征
5、AMF在蛋白水平下调根表皮表达的ZmAMT1s
通过RT-qPCR法和蛋白质组学分别定量比较ZmAMT基因在转录水平和蛋白质水平上的表达，来研究了玉米根系-N和Myc-N途径之间的关系
图5A和B: 在42d的玉米菌根中, ZmAMT3;1的转录和蛋白丰度分别是非菌根的100倍和60倍。菌根接种后，ZmAMT1;1a和ZmAMT1;3的转录本没有变化(图5A)，但有趣的是，ZmAMT1;1a和ZmAMT1;3蛋白的丰度显著下调至其水平的一半(图5B)。
图5C: 如磷蛋白组学分析所示，在ZmAMT1;1a的T452和ZmAMT1;3的T452和S470处检测到了菌根诱导的磷酸化修饰
图4B、C和5C: 然而，在菌根接种下，没有检测到ZmAMT3;1的假定的磷位点，这表明ZmAMT3;1的去磷酸化状态是转运蛋白的活性状态
在AMF的存在下，S471磷酸化修饰增强，可能是由于蛋白丰度的增加，但它并不抑制ZmAMT3的转运蛋白活性。这些结果表明，AMF定殖上调了ZmAMT3;1的转录和蛋白水平，从而诱导了Myc-N途径，同时在翻译和翻译后水平下调了表皮表达的ZmAMT，从而抑制了Root-N途径。
图5: 接种AMF的玉米根系中ZmAMTs的调控
6、ZmAMT3;1介导的15N从丛枝菌根真菌到寄主植物的转移
为了研究ZmAMT3;1在AMF向寄主植物转移氮中的作用，利用基于RNAi的沉默方法获得了表达下调的ZmAMT3;1转基因玉米品系。通过DNA凝胶印迹分析鉴定出两个独立的单拷贝转基因，并与野生型B73回交
图6B: 在42dpi的玉米菌根中，ZmAMT3;1在两个RNAi系中的转录显著减少。
图6C: 在RNAi系的菌根中，其他ZmAMT的转录本在RNAi系的菌根中不受影响，表明ZmAMT3;1的特异性抑制
图6D-F: 为了确定ZmAMT3;1是否是维持AMF共生所必需的，比较了ZmAMT3;1-RNAi品系与相应的WT在28、35和42dpi后的AMF定殖度和形态
WT和RNAi品系的总定殖率高达80%，差异不显著。在这些基因型中，菌丝、小泡和丛枝芽的根长所占的百分比也是相似的。这些结果表明，ZmAMT3;1的功能对AMF在玉米根中的定植和发育并不是至关重要的。
图6: 沉默ZmAMT3;1基因不影响菌根共生
图7A: 在盆栽试验中，放置了一块15NH4标记的土壤斑块，允许仅有AMF菌丝进入，以追踪从AMFs到寄主植物的N转移
图7B和C: 在AMF侵染和植物生长方面，Wt和RNAi之间没有观察到基因差异。然而，允许AMF进入15N标记管道(30-μm Myc)的Wt植物的地上部15N丰度显著高于不允许AMF进入标记管道(0.45-μm Myc)的WT植物。当菌丝穿过30μm的膜到达15N标记管时，地上部15N的增量可以认为是通过菌丝从15N土块吸收15NH4+，然后从AMFS转移到寄主植物。然而，在这两个RNAi系中，这种依赖菌根的地上部15N的积累完全丧失，表明ZmAMT3;1在将N从AMFs转移到植物中起着关键作用。
综上所述，我们得出结论：ZmAMT3;1是玉米吸收Myc-N所必需的。
图7: ZmAMT3;1介导了15N从AMF向玉米植株的转移
7、ZmAMT3;1主导Myc-N途径,对整个植物氮素营养有重要贡献
图8A: 在分离室实验中，与根室(RC)分开的菌丝室(HC)排除了根氮吸收的影响，量化Myc-N对植物总氮吸收的贡献
图8B和C: 对于Wt植株，30μm Myc处理允许AMF菌丝进入HC以获取额外的N，HC菌丝对Myc-N的吸收，分别占总地上部N积累量的33%和42%。然而，对于两个RNAi系，由于沉默ZmAMT3;1基因表达，增加的地上部N积累明显较少。
这表明从HC摄取Myc-N的能力有68%和74%是由ZmAMT3;1赋予的。虽然AMF对N获得的显著贡献也在RC中被确定，但它们在Wt和RNAi系之间没有区别。
图8D和E: 对地上部P含量的进一步分析表明，在Wt植株中，从HC吸收的Myc-P占总地上部P积累量的21%和23%。然而，我们发现Wt和RNAi植株对Myc-P的吸收没有差异，表明ZmAMT3;1在Myc-N途径中具有排他性功能。
图8: 定量ZmAMT3；1介导的Myc-N吸收对植物整体N的吸收
8、依赖于ZmAMT3;1的Myc-N途径对大田玉米吐丝后氮素吸收有显著贡献
我们随后评估了ZmAMT3;1介导的Myc-N途径在两年(2018和2019年)不同发育阶段(拔节期、吐丝期和成熟期)对大田玉米氮素吸收的贡献
图9A-D: 在主要生长期，玉米植株的地上部生物量和含氮量逐渐增加，并在成熟时达到最大值。在拔节期和吐丝期，Wt和RNAi的地上部N含量没有显著差异。然而在成熟时，RNAi品系3-18和3-46的地上部N积累显著减少。WT植株吐丝后的氮素吸收在每株776-800毫克(2018)到925-1,275毫克(2019)之间，占整个生育期总氮素吸收的40%-50%。然而，两个RNAi系的吐丝后氮素吸收大幅减少，每株分别减少252-275 mg(2018)和507-740 mg(2019)N。
因此，我们得出结论，在田间条件下，33%-58%的吐丝后氮素吸收是由ZmAMT3;1介导的Myc-N途径贡献的。
图9: ZmAMT3;1介导的Myc-N途径对大田玉米吐丝后氮素吸收的贡献
讨论
ZmAMT3;1通过共生界面介导NH3的运输，将AMF中的N输送到玉米植株
在田间条件下，依赖于ZmAMT3;1的Myc-N途径对后期植物氮素的总吸收有显著贡献
综上所述，我们的结果表明，Myc-N途径对于玉米的氮素吸收是至关重要的，特别是对于吐丝后大田的氮素吸收。因此，我们提出了以下玉米根中Myc-N吸收途径的模型(图10)。在AMF接种下，ERM以无机或有机N的形式吸收N，并将其代谢成Arg，Arg与Poly-P一起转运到IRM。在IRM中，这些运输形式被分解，NH4(或NH3)从IRM释放到界面质外体。NH4通过ZmAMT3;1转运体很可能以NH3的形式转移到根细胞。这两个吸收系统的并行存在可能会导致不希望的权衡，因为根-N吸收活性随着根AMF定殖率的增加而下降。这可能低估了依赖于ZmAMT3;1的Myc-N吸收对整个植物N营养的贡献。识别调控Root-N和Myc-N途径的上游调控因子将是进一步研究的重要内容。
图10: 玉米根部丛枝菌根依赖的铵吸收途径的模型
为了增强农业的可持续性，我们可以基于自然遗传变异或基因编辑，通过探索ZmAMT3;1的优势/新等位基因来改造吸收更多Myc-N的作物。我们还发现了一个有趣的发现，AMFS可能下调根表皮中其他AMT进行的直接根N吸收活性。确定调节Myc-N和根-N吸收途径的上游调控因子值得进一步研究。
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