Nature Plants｜GTP酶AtGBPL3在植物核膜形成和形态发生过程中的作用机制解析

发动蛋白超家族的大型GTP酶共享一个高度保守的特征结构域，与GTP酶活性有关，但在该特征域之外显示出相当大的结构变异。鸟苷酸结合蛋白(GBPs)是发动蛋白超家族的成员之一，是动物和植物中重要的免疫调节因子。

2023年4月24日，植物学顶级杂志Nature Plants在线发表了来自德国埃尔朗根-纽伦堡大学Benedikt Kost教授团队的题为“The large GTPase AtGBPL3 links nuclear envelope formation and morphogenesis to transcriptional repression”的研究文章，研究表明AtGBPL3在子细胞核表面的积累会导致核膜重组，揭示了AtGBPL3突变体根部在这一过程中的缺陷，这些缺陷导致细胞程序性死亡并损害生长。

首先作者研究了AtGBPL3的GTPase活性、结构域以及表达模式。AtGBPL3在其氨基端附近包含一个GBP结构域，该结构域在发动蛋白超家族中是高度保守的，与GTPase活性有关。含有该结构域的重组AtGBPL3片段将GTP转化为GTP，转化率为1.87±0.27 min−1，但没有进一步将GTP水解为GMP。此外，该片段仅显示最小的GTPase活性，转化率为0.022±0.016 min−1。qRT-PCR分析显示，AtGBPL1、AtGBPL2和AtGBPL3基因表达水平普遍很低。为了进一步研究AtGBPL3基因的表达模式，作者构建了含有AtGBPL3-GUS或AtGBPL3-GFP融合基因的转基因拟南芥报告系，在AtGBPL3启动子的控制下表达AtGBPL3-GUS或AtGBPL3- GFP融合蛋白。AtGBPL3-GUS报告系的组织化学研究显示，幼嫩叶片、主根和侧根顶端的GUS活性最强(蓝色染色)。AtGBPL3 - GFP报告系的共聚焦成像证实了AtGBPL3普遍表达，并特异性地在根尖细胞核内积累（图1）。

图1：拟南芥GBPs基因结构域、GTPase活性及表达模式研究

之后，作者使用CRISPR/Cas9技术敲除AtGBPL3基因。纯合突变体gbpl3-5在AtGBPL3启动子的5ʹ非翻译区上游30 bp处携带一个T-DNA插入，以约26%的野生型水平表达全长AtGBPL3转录本。这些突变体的根表现出强烈的生长抑制，在种子萌发后7天还达不到正常长度的一半，而成熟芽的整体形态没有改变。在gbpl3-5背景下，作者生成了三个独立的互补品系，其中gbpl3-5comp2系中AtGBPL3的表达恢复到野生型，而gbpl3-5comp1和gbpl3-5comp3则恢复到更高水平。这些互补系均显示正常的根生长，表明AtGBPL3在c -末端融合到GFP时仍具有功能，过表达时不影响根的生长（图2）。

图二：gbpl3-5 T-DNA插入突变体的分子和表型特征

在大多数gbpl3-5根细胞中，SUN1-GFP标记的核膜在细胞分裂过程中的动态遵循与WT细胞相同的模式，然而偶尔有一个或两个子细胞在外层细胞分裂后不能改变核膜，而是形成无定形的SUN1-GFP聚集体。延时成像证实，这些子细胞最终死亡。有趣的是，SUN1-GFP标记还显示，位于根顶端分生组织上方的分化gbpl3-5细胞的细胞核圆形度显著增加，核大小显著减小。有趣的是，与PCD诱导和根生长降低相比，gbpl3 -5幼苗核形态发生缺陷不仅被野生型的GBPL3挽救，同时也能被内源表达的AtGBPL3K83A挽救（图3）。

图三：通过稳定表达SUN1-GFP融合蛋白，可以观察到gbpl3-5细胞核膜形成和细胞核形态的缺陷。

最后，作者研究表明与AtGBPL3相互作用的染色质不仅在着丝粒组蛋白标记HTR12/CENH3中显著富集，而且在H3K27me3和其他与着丝粒周围异染色质和/或LADs相关的抑制性组蛋白修饰中也显著富集，表明AtGBPL3具有转录抑制的功能。上调和下调的gbpl3-5差异表达基因分布在所有5条染色体上，反映了总体的基因密度，与着丝粒和邻近的着丝粒周围区域的关联减少，其中mail1型差异表达基因特异富集。重要的是，gbpl3-5差异表达基因与WT细胞中预测的处于转录抑制状态的染色质区域存在强烈重叠，其特征是高水平的H3K27me3组蛋白修饰。此外，gbpl3-5、crwn1-1/4-1和crwn1-1三种突变体的上调差异表达基因的相关分析显示存在相当多的重叠（图4）。

综上所述，研究表明GBP同源基因AtGBPL3除了之前报道的在病原体防御中的作用外，它在重要的细胞过程中具有重要的功能，如核膜重组，核外周的核形态发生和转录抑制。这些发现揭示了这些看似不相关的过程之间的调控联系，并揭示了它们共同依赖于发动蛋白超家族中的大型GTP酶。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41477-023-01400-5

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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