细菌双链DNA（dsDNA）胞嘧啶脱氨酶DddAtox衍生的胞嘧啶碱基编辑器（DdCBE）及其进化变体DddA11在转录激活物样效应蛋白（TALE）的引导下，能够在TC或HC（H=A、C或T）序列背景下编辑线粒体DNA（mtDNA），而对于GC靶标来说，它仍然相对无法实现。
2023年5月3日，上海交通大学医学院附属第九人民医院上海精准医学研究院乔云波课题组、军事医学研究院王升启课题组及中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心刘真课题组合作在Molecular Cell 在线发表题为“A DddA ortholog-based and transactivator-assisted nuclear and mitochondrial cytosine base editors with expanded target compatibility”的研究论文，该研究发现了一种基于DddA直系同源物和反式激活蛋白辅助的核和线粒体胞嘧啶碱基编辑器，具有广泛的靶标兼容性。
该研究从 DddAtox 同源物中成功筛选到一种新型双链 DNA 脱氨酶，该酶源自一种肠道菌毒素 (Roseburia intestinalis interbacterial toxin, riDddAtox)。随后，该研究使用 riDddAtox 成功开发了 CRISPR 系统介导的核基因胞嘧啶碱基编辑器 crDdCBE（CRISPR-mediated nuclear DdCBEs, crDdCBEs）和 TALE 系统介导的线粒体基因胞嘧啶碱基编辑器（mitochondrial CBEs, mitoCBEs），分别在核基因和线粒体基因实现了高效的双链 DNA 编辑，其催化细胞核和线粒体基因中HC和GC靶点的C-to-T编辑。此外，反式激活蛋白（VP64、P65或Rta）与DddAtox或riDddAtox-介导的crDdCBEs和mitoCBEs的尾部融合显著提高了细胞核和mtDNA编辑效率，分别提高了3.5倍和1.7倍。该研究还使用基于riDddAtox和Rta辅助的mitoCBE来有效刺激培养细胞和小鼠胚胎中与疾病相关的mtDNA突变，在非TC靶点的转化率高达58%。
另外，2022年4月25日，韩国基础科学研究所Jin-Soo Kim（音译，金镇洙）团队在Cell 在线发表题为“Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases”的研究论文，该研究该提出了可编程的 TALE 连接脱氨酶，由定制设计的 TALE 蛋白、分裂或催化缺陷的 DddA 变体和工程化的腺嘌呤脱氨酶组成，可诱导人线粒体中的靶向 A-to-G 编辑。此外，正如最近 DdCBEs 所示，编码植物中数百个基因的叶绿体 DNA（其中许多基因对光合作用至关重要）可以用植物兼容的 TALED 进行编辑，从而开启植物遗传学和生物技术的新篇章（点击阅读）。
2022年4月4日，博德研究所刘如谦团队在Nature Biotechnology 在线发表题为“CRISPR-free base editors with enhanced activity and expanded targeting scope in mitochondrial and nuclear DNA”的研究论文，该研究为了提高编辑效率并克服 DddA 严格的 TC 序列约束，使用噬菌体辅助的非连续和持续进化来进化具有改进活性和扩大靶向范围的 DddA 变体。与经典的 DdCBE 相比，具有进化 DddA6 的碱基编辑器将 TC 的线粒体 DNA (mtDNA) 编辑效率平均提高了 3.3 倍。含有进化的 DddA11 的 DdCBE 为线粒体和核碱基编辑提供了更广泛的 HC（H = A、C 或 T）序列兼容性，将 AC 和 CC 靶标的平均编辑效率从标准 DdCBE 的不到 10% 提高到 15-30% 。该研究使用这些进化的 DdCBE 在非 TC 靶位点有效地在人类细胞中安装与疾病相关的 mtDNA 突变。DddA6 和 DddA11 大大提高了全蛋白碱基编辑的有效性和适用性（点击阅读）。
2022年3月18日，中国农业科学院深圳农业基因组研究所左二伟、中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉、上海脑科学与类脑研究中心/临港国家实验室胥春龙、上海交通大学章美玲共同通讯在 Cell Discovery （IF=11）在线发表题为“Mitochondrial base editor DdCBE cause substantial DNA off-target editing in nuclear genome of embryos” 的研究论文，该研究使用 GOTI方法（点击阅读），以评估 DdCBE 对 mtDNA 和核 DNA 修饰的脱靶效应。该研究首次展示了 DdCBE 在整个核基因组中导致数千个脱靶 SNV，这些 SNV 富含 C-to-T/G-to-A 转换，这是低保真碱基编辑器 BE3 产生的 SNV 数的两倍。总之，该研究发现DdCBE 对核基因组具有广泛的脱靶效应，强烈需要优化 DdCBE 以在 mtDNA 上进行特定的碱基编辑，特别是在用于治疗线粒体疾病之前（点击阅读）。
2022年2月1日，上海交通大学章美玲，李文及中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉共同通讯在 Cell Discovery 在线发表题为“Human cleaving embryos enable efficient mitochondrial base-editing with DdCBE” 的研究论文，该研究表明，DdCBE 是一种有效的碱基编辑器，可在人类胚胎 mtDNA 中诱导点突变，并且在 8 细胞胚胎中的效率要高得多。 鉴于旁观者和脱靶编辑特征，DdCBE 仍有待进一步优化用于未来的基础和治疗研究。
2022年2月1日，南京医科大学许争锋、沈斌及凌秀凤共同通讯在 Cell Discovery 在线发表题为“DdCBE-mediated mitochondrial base editing in human 3PN embryos” 的研究论文，该研究首次证明了在人类 3PN 胚胎中进行 DdCBE 介导的线粒体碱基编辑的可行性，表明在人类早期胚胎阶段进行致病性 mtDNA 突变校正的可能性。
2020年7月8日，博德研究所David R. Liu及华盛顿大学医学院Joseph D. Mougous共同通讯在Nature 在线发表题为“A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing”的研究论文，该研究描述了一种细菌间毒素，将其命名为DddA，它可以催化dsDNA中胞苷的脱氨。不含CRISPR的DdCBE可以精确操纵mtDNA，而不是消除因被靶向核酸酶切割而产生的mtDNA拷贝，这对线粒体疾病的研究和潜在治疗具有广泛的意义（点击阅读）。
线粒体是半自主的细胞器，有自己的基因组，线粒体DNA（mtDNA），是一种多拷贝、环状、双链DNA（dsDNA）分子，编码数十种蛋白质和RNA。由于线粒体在能量产生和稳态、信号转导和程序性细胞死亡中的重要作用，mtDNA的4个错义突变会导致一系列临床表现，如神经肌肉疾病、Leigh综合征（LS）、进行性肌无力和线粒体脑肌病。因此，开发能够将突变精确安装到mtDNA中的生物技术将有助于线粒体遗传病的建模和治疗。
含有线粒体靶向序列（MTS）的限制性内切酶（mitoRE）和可编程核酸酶，包括锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活子样效应核酸酶（TALENs），可以被引入线粒体中，以切割所需的mtDNA序列，从而选择性地消除有害的mtDNA。最近报道的DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器（DdCBEs），在培养的细胞、动物、植物和人类胚胎中，在mtDNA的5’-TC序列中实现靶向C、G到T、A的转化。为了缓解DdCBEs的严格序列约束，进化的DddAtox变体 DddA11 是从噬菌体辅助的连续进化中获得的，具有改进的编辑频率和扩大的 HC（H = A、C 或 T）序列相容性。然而，相对于TC靶标，DddA11诱导的编辑效率在一些AC和CC靶标上保持中等，并且相对不适用于GC靶标。
机理模式图（图源自Molecular Cell ）
该研究设计了riDddAtox介导和反式激活蛋白辅助的核和mitoCBEs，这些CBE在培养的人和小鼠细胞系中对HC和GC靶点表现出高效的C.G-to-T.A转化。该研究还利用Rta融合的mitoCBE2.1将非TC位置的疾病相关C-to-T突变安装到细胞系和早期小鼠胚胎的mtDNA中，证明了具有拓宽序列兼容性的工程化mitoCBE2.1在疾病建模中的实用性。
原文链接：
https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(23)00283-6
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